附件：曲霉核酸檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（2024年第1號）.doc

曲霉核酸檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對曲霉核酸檢測試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門提供參考。

本指導(dǎo)原則是對曲霉核酸檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用。若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

真菌的生物分類包括門、綱、目、科、屬等，本指導(dǎo)原則對真菌的分類描述如無特殊說明均為“種”，如指“目”或“屬”等均已在原文中明確。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于采用實時熒光PCR法，對肺泡灌洗液、痰液、組織樣本等中的曲霉核酸進行體外定性檢測的試劑，包含曲霉屬（Aspergillus）通用型核酸檢測試劑和曲霉屬中一個或多個菌種的檢測試劑。檢測結(jié)果臨床上用于肺曲霉病的輔助診斷。

對于采用其他方法學(xué)的曲霉核酸檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請人應(yīng)參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進行評價，并補充其他的評價資料。

本指導(dǎo)原則適用于曲霉核酸檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導(dǎo)原則針對曲霉核酸檢測試劑注冊申報資料中的部分內(nèi)容進行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)的要求，同時建議參考《定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則》等適用的技術(shù)文件要求。

二、注冊審查要點

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)體現(xiàn)檢測目標(biāo)病原體，如曲霉核酸檢測試劑盒（實時熒光PCR法）、煙曲霉核酸檢測試劑盒（實時熒光PCR法）等。該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報前與監(jiān)管機構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。明確產(chǎn)品檢測靶基因，提供引物和探針的設(shè)計依據(jù)。提供核酸提取（手工和自動提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴增的時間，提供不同適用機型的檢測通量（如適用）。與已上市同類產(chǎn)品或前代產(chǎn)品進行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。提供樣本類型選擇的依據(jù)。提供產(chǎn)品預(yù)期用途和臨床適應(yīng)證，明確適用人群的情況。

（三）非臨床資料

1.分析性能研究

分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的曲霉陽性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽性和濃度水平，提交具體的試驗資料，并明確培養(yǎng)和鑒定結(jié)果。分析性能評估用樣本均應(yīng)采用真實樣本（臨床樣本或培養(yǎng)菌株），如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。也可采用人工構(gòu)建樣本（如質(zhì)粒）進行研究，此部分研究可作為額外研究資料提交注冊。對于各項性能中采用的樣本，在下述各項性能研究資料中分別提供樣本信息列表。檢出限和包容性研究中所用樣本應(yīng)相互獨立。

1.1樣本穩(wěn)定性

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行詳細(xì)研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，加入不同裂解液/消化液的樣本，滅活處理后的樣本（如適用），研究內(nèi)容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數(shù)等。

如產(chǎn)品適用不同的樣本類型，應(yīng)對每種樣本類型進行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取液可不立即進行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進行研究。

1.2企業(yè)參考品驗證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細(xì)的試驗數(shù)據(jù)。

1.3精密度

應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實驗室內(nèi)精密度、實驗室間精密度、批間精密度等結(jié)果。

采用培養(yǎng)菌株進行精密度評價，應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強陽性樣本，采用孢子/mL作為菌株濃度的表示方式，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅纾?/p>

陰性樣本：不含待測物，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

臨界陽性樣本：待測物濃度為試劑盒的檢出限濃度，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

1.4包容性

1.4.1采用生物信息學(xué)方法對產(chǎn)品檢測的包容性進行研究，研究應(yīng)覆蓋已公布的曲霉核酸序列。

1.4.2根據(jù)試劑盒檢測范圍選擇進行包容性驗證的曲霉種，使用具有不同時間和區(qū)域特征性的不同來源的臨床樣本或培養(yǎng)菌株進行驗證，每種菌種至少使用3例樣本，研究應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗證。

對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑，樣本應(yīng)覆蓋已知曲霉屬中的主要致病菌種，至少包含煙曲霉（A.fumigatus）、黃曲霉（A.flavus）、黑曲霉（A.niger）、土曲霉（A.terreus）、構(gòu)巢曲霉（A.nidulans）、米曲霉（A.oryzae）、聚多曲霉（A.sydowii）、雜色曲霉（A.versicolor）、亮白曲霉（A.candidus）、灰綠曲霉（A.glaucus）。

1.5檢出限

根據(jù)試劑盒檢測范圍選擇進行檢出限驗證的曲霉種。如為曲霉屬通用型核酸檢測試劑，應(yīng)至少對煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉分別進行檢出限的確定和驗證。

1.5.1檢出限的確定

建議使用培養(yǎng)菌株系列稀釋于與適用樣本一致的陰性基質(zhì)中，進行檢出限的確定。每個濃度梯度重復(fù)檢測，記錄不同濃度檢出的結(jié)果，采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ停ㄈ鏟robit分析）和分析方法，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。建議申請人采用孢子/mL作為菌株濃度的表示方式，明確計數(shù)方法。除此之外，申請人還應(yīng)確定LOD水平的CFU/mL濃度；采用數(shù)字PCR、標(biāo)準(zhǔn)曲線（通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或構(gòu)建質(zhì)粒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）等方法進行菌株核酸濃度的確認(rèn)，以copies/mL作為菌株濃度的表示方式。應(yīng)明確每份菌株的來源、濃度、制備方法等信息。

1.5.2檢出限的驗證

建議使用至少5份不同來源的最低檢測限水平的培養(yǎng)菌株，進行至少20次的重復(fù)驗證，陽性檢出率不低于95%。注冊申請人應(yīng)能夠提供用于最低檢測限驗證的各個菌株的來源、制備方法及濃度等信息。

1.6分析特異性

1.6.1交叉反應(yīng)

1.6.1.1交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面：近緣菌、易引起相同或相似的臨床癥狀微生物、感染部位附近的定植菌等，研究樣本具體見表1。

1.6.1.2建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 CFU/mL或更高。

1.6.1.3申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的微生物的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗資料。

1.6.2干擾試驗

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行試驗，檢測包含臨界陽性水平在內(nèi)的曲霉樣本。對結(jié)果進行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。用于干擾試驗研究的物質(zhì)具體見表2。

1.7核酸提取/純化性能

在進行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的為有效破環(huán)真菌細(xì)胞壁，分離出目的核酸，并應(yīng)具有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。

研究確定核酸提取方法，闡述核酸提取原理，提交提取方案選擇研究資料。對配合使用的所有核酸提取試劑進行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑至少進行抗干擾、再現(xiàn)性和檢出限的驗證，如果配套核酸提取試劑提取原理存在差異，還需額外進行檢出限的建立研究。

1.8反應(yīng)體系

1.8.1樣本采集和處理

1.8.1.1樣本采集方式的選擇和樣本采集量的要求。

1.8.1.2樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

1.8.1.3樣本處理方式的選擇：研究樣本適用的滅活方式，消化方式（如適用）、保存方式，包括樣本用量、保存溫度、時間等。

1.8.2核酸提取和反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。

提交不同適用機型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗證資料。

2.穩(wěn)定性研究

申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及統(tǒng)計分析結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

3.陽性判斷值研究

陽性判斷值確定資料主要指對申報產(chǎn)品核酸檢測的Ct值，即結(jié)果判斷的臨界值進行確認(rèn)的資料。陽性判斷值研究樣本來源應(yīng)為預(yù)期人群，如臨床需要進行肺曲霉病診斷或鑒別診斷的病例，并考慮不同年齡、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性，盡量納入較多的弱陽性樣本，以及一定數(shù)量的其他容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的樣本。對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑應(yīng)納入不同曲霉種樣本進行研究，并分別進行統(tǒng)計分析，建議研究的菌種類型與檢出限研究要求相同。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式確定申報試劑用于結(jié)果判斷的臨界值，明確檢測結(jié)果判定依據(jù)，提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。如判定值存在灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。

另外，考慮建立陽性判斷值時使用的臨床樣本對于目標(biāo)人群的代表性，建議通過臨床評價進一步驗證和確認(rèn)陽性判斷值的準(zhǔn)確性。

如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進行陽性判斷值的驗證。

提供內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍的確定方法和研究資料。

4.其他資料

4.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。供應(yīng)商應(yīng)進行必要的篩選或評價，供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。（如該原料為平臺通用原料，比如酶、dNTP等在其他項目上已篩選并平臺通用，可直接進行驗證。）

4.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應(yīng)情況。建議設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對產(chǎn)品檢出限、包容性和特異性進行評價。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗等。

4.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等的詳細(xì)驗證資料。

4.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別明確酶性能的要求，對酶活性、功能性等進行評價和驗證。

4.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)采用滅活曲霉培養(yǎng)物。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

4.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴增。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進行監(jiān)控。

4.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和精密度參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗證資料。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本，或者使用培養(yǎng)物加入陰性基質(zhì)。呼吸道樣本建議采用滅活的菌株加入模擬基質(zhì)建立企業(yè)參考品。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品：應(yīng)著重考慮不同來源的曲霉樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同病例來源的3個曲霉種樣本。對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑，陽性參考品應(yīng)至少包含煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉，每個菌種包含不同病例來源的3個曲霉種樣本。（參考品應(yīng)設(shè)置不同濃度水平。）

陰性參考品：主要涉及對交叉反應(yīng)的驗證情況，建議包括定植部位相同、引發(fā)癥狀相近的其他病原體，包括檢測范圍外的曲霉種（煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉）、毛霉目常見菌種、念珠菌屬常見菌種、賽多孢霉、耶氏肺孢子菌、新生隱球菌、馬爾尼菲籃狀菌、鐮刀菌屬、青霉屬。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。對于曲霉屬通用型核酸檢測試劑，應(yīng)至少包含煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉。

精密度參考品：應(yīng)包含略高于檢出限濃度水平的陽性樣本。

4.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評價資料

該類試劑應(yīng)通過臨床試驗路徑進行臨床評價。臨床試驗應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范》和《體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗應(yīng)符合更新后的要求。下面僅說明該類產(chǎn)品臨床試驗中應(yīng)關(guān)注的重點問題。

1.臨床試驗機構(gòu)

應(yīng)選擇具備相應(yīng)條件且按照規(guī)定備案的醫(yī)療器械臨床試驗機構(gòu)開展臨床試驗。肺曲霉病屬于呼吸系統(tǒng)感染性疾病，建議申請人在呼吸系統(tǒng)疾病及傳染病方面具有優(yōu)勢的臨床機構(gòu)開展臨床試驗。臨床試驗機構(gòu)數(shù)量應(yīng)不少于3家，且具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，試驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個試驗中，試驗體外診斷試劑和對比方法均應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

2.臨床試驗方法

2.1與對比方法的比較研究

2.1.1對于已有同類產(chǎn)品上市的，臨床試驗應(yīng)選擇已上市的同類產(chǎn)品作為對比試劑，評價申報產(chǎn)品與已上市同類產(chǎn)品的一致性。對比試劑的選擇應(yīng)考慮檢測的曲霉范圍、適用的樣本類型、產(chǎn)品性能等方面應(yīng)與試驗體外診斷試劑具有良好的可比性，選擇已上市同類產(chǎn)品進行臨床試驗時，對比試劑配套使用的核酸提取試劑應(yīng)滿足其說明書要求。針對不一致樣本處理，可采用其他已上市同類產(chǎn)品、病原體分離培養(yǎng)、測序等方法進一步確認(rèn)。

2.1.2對于尚無同類產(chǎn)品上市的，申請人可采用試驗體外診斷試劑與核酸序列測定（Sanger測序）方法進行對比試驗，評價兩種檢測方法的一致性。同時還應(yīng)進行部分與曲霉屬分離培養(yǎng)鑒定的對比試驗。以上兩方面評價結(jié)果結(jié)合起來共同論證試驗體外診斷試劑的臨床性能。

臨床試驗資料中應(yīng)對測序方法進行詳細(xì)的介紹，應(yīng)采用公認(rèn)的靶基因進行測序，針對靶基因的選擇應(yīng)提供依據(jù)。明確檢測過程中配套使用的核酸提取試劑，針對測序方法提交性能驗證數(shù)據(jù)，證明測序方法與試驗體外診斷試劑的可比性。如測序試驗委托其他機構(gòu)完成，還應(yīng)提交由臨床試驗機構(gòu)委托第三方機構(gòu)/實驗室開展相關(guān)試驗的測序服務(wù)合同/協(xié)議，提交相關(guān)機構(gòu)資質(zhì)和選擇依據(jù)。

2.2與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究

在上述比較研究的基礎(chǔ)上，申請人還收集病例的臨床診斷信息，進一步評價申報產(chǎn)品在確診病例、臨床診斷病例、及其他病例中的檢出性能。肺曲霉病診斷的臨床參考標(biāo)準(zhǔn)可參考臨床公認(rèn)的侵襲性肺曲霉病、慢性肺曲霉病、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

3.臨床試驗受試人群的選擇

臨床試驗的受試人群應(yīng)來自產(chǎn)品的預(yù)期適用人群，該產(chǎn)品的適用人群為臨床需要進行肺曲霉病診斷或鑒別診斷的病例。

曲霉是條件致病性真菌，全身或局部免疫缺陷的人群易發(fā)生曲霉感染。臨床試驗入組人群應(yīng)為易發(fā)生曲霉感染的人群如：粒細(xì)胞缺乏、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、器官移植、遺傳或獲得性免疫缺陷等人群。肺曲霉亦可發(fā)生在慢性阻塞性肺部疾病、糖尿病等非粒細(xì)胞缺乏的人群，因此，臨床試驗也應(yīng)涵蓋上述人群。

病例入組過程中應(yīng)考慮涵蓋不同的肺曲霉病的患者，如侵襲性肺曲霉病、慢性肺曲霉?。▎渭冃苑吻骨颉⒙钥斩葱苑吻共?、慢性纖維化性肺曲霉病、曲霉結(jié)節(jié)、亞急性侵襲性肺曲霉病）、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病等。

申請人在進行臨床試驗時還應(yīng)入組部分需要進行鑒別診斷的等其他真菌感染患者，此外臨床試驗應(yīng)納入部分病原體載量較低的病例（其中包括接受抗真菌治療的患者）。

曲霉在自然界廣泛分布，且僅有少數(shù)健康人感染曲霉后致病，臨床試驗不建議入組一般健康人群及機體免疫功能（狀態(tài)）正常的人群。

4.臨床試驗樣本類型

曲霉核酸檢測可能涉及的樣本類型包括痰液、肺泡灌洗液、組織樣本等。臨床樣本的采集建議按照國家衛(wèi)健委發(fā)布的相關(guān)實驗室檢測技術(shù)方案執(zhí)行。

如申報產(chǎn)品適用于不同的樣本類型，應(yīng)針對不同樣本類型分別進行臨床性能評價，包括分別進行樣本量的估算等。

5.臨床試驗樣本量

建議以與對比方法的比較研究為基礎(chǔ)進行樣本量估算。臨床試驗陽性樣本和陰性樣本數(shù)量應(yīng)分別滿足統(tǒng)計學(xué)要求。針對與Sanger測序法或同類已上市產(chǎn)品的對比試驗，可采用目標(biāo)值法公式分別估算最低陽性和陰性樣本例數(shù)。

樣本量估算公式如下，

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評價指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為申報產(chǎn)品評價指標(biāo)預(yù)期值。

其中陽性符合率和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。臨床試驗結(jié)果中，相關(guān)評價指標(biāo)的95%置信區(qū)間下限應(yīng)不低于預(yù)設(shè)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)評價指標(biāo)P接近100%時，上述樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進行樣本量估算和統(tǒng)計學(xué)分析，如精確概率法等。

對人類致病的曲霉最常見的是煙曲霉、其次是黃曲霉、黑曲霉、土曲霉和構(gòu)巢曲霉等，針對曲霉屬通用型核酸檢測試劑，臨床試驗入組病例應(yīng)至少能夠涵蓋臨床常見的曲霉種：煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉。

曲霉為具有細(xì)胞壁的真菌，核酸提取試劑的性能直接影響產(chǎn)品的檢測性能。如申報產(chǎn)品配套多個核酸提取試劑，臨床試驗應(yīng)以一種核酸提取試劑為主開展臨床試驗，其余配套核酸提取試劑應(yīng)在不少于兩家臨床試驗機構(gòu)，選擇不低于200例病例進行臨床研究。入組病例中陰陽性病例的分配應(yīng)能夠滿足評價產(chǎn)品性能要求。

6.臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析

臨床試驗結(jié)果一般以四格表的形式進行總結(jié)，并據(jù)此計算試驗體外診斷試劑的靈敏度和特異度，或與對比方法的陽性/陰性符合率及其95%置信區(qū)間。

臨床試驗報告中應(yīng)對入組受試者的基本情況進行分析，包括受試者年齡、性別的分布情況，以及臨床診斷背景等。特別應(yīng)針對用于特異性評價的各類受試者進行歸類匯總，確認(rèn)入組樣本具有較好的代表性。臨床試驗中如涉及不同樣本類型，應(yīng)針對每種樣本類型分別進行統(tǒng)計分析。

曲霉屬通用型核酸檢測試劑，應(yīng)對每種曲霉檢測的臨床性能進行分層分析，不同曲霉間產(chǎn)品性能應(yīng)不存在顯著差異。

臨床試驗中所有不一致結(jié)果均應(yīng)結(jié)合患者的流行病學(xué)背景、臨床癥狀、臨床診斷以及疾病治療、轉(zhuǎn)歸等信息進行充分的分析。臨床試驗結(jié)果應(yīng)能夠證明產(chǎn)品臨床性能滿足臨床要求。

7.境外臨床試驗數(shù)據(jù)的認(rèn)可

境外臨床試驗數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗數(shù)據(jù)的注冊審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。提交完整的臨床試驗方案、報告和倫理審查意見，以及該數(shù)據(jù)適用于中國患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗質(zhì)量管理差異的對比資料和臨床試驗質(zhì)量管理差異對于臨床試驗結(jié)果影響的論證資料。

注冊申請人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗技術(shù)審評要求，論證境外臨床試驗數(shù)據(jù)的充分性。

8.臨床證據(jù)的形式要求

申請人應(yīng)按照《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》、《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機構(gòu)倫理審查意見、臨床試驗方案、臨床試驗小結(jié)、臨床試驗報告以及臨床試驗數(shù)據(jù)庫。

臨床試驗數(shù)據(jù)匯總表中應(yīng)提供病例的臨床診斷結(jié)果及支持病例臨床診斷結(jié)果的信息。

9.其他注意事項

該類產(chǎn)品樣本處理及核酸提取試劑會影響產(chǎn)品檢測性能，臨床試驗在選擇已上市同類產(chǎn)品進行臨床試驗時，特別注意，對比試劑配套使用的核酸提取試劑應(yīng)滿足其說明書要求。

（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進行標(biāo)注，并單獨列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。曲霉核酸檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點關(guān)注以下內(nèi)容。

1．【預(yù)期用途】

1.1本試劑盒用于體外定性檢測需要進行xxx病診斷或鑒別診斷者的xxx樣本（具體描述樣本類型）中的曲霉屬（或某一曲霉種DNA。

1.2臨床上易發(fā)生曲霉感染的人群如：粒細(xì)胞缺乏、血液系統(tǒng)惡性腫瘤、器官移植、遺傳或獲得性免疫缺陷、慢性阻塞性肺部疾病、糖尿病等人群。

1.3簡單介紹曲霉病原學(xué)特征、流行病學(xué)特征以及臨床表現(xiàn)和現(xiàn)有診斷方法等。

1.4強調(diào)本試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實驗室檢測對病情進行綜合分析。

2.【檢驗原理】

簡述產(chǎn)品的核酸提取和PCR原理。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進行簡要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑，樣本保存液，樣本消化液等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號或注冊證號、備案號等信息。

4.【樣本要求】

需詳細(xì)描述樣本采集、保存、運輸和處理方式，包括采樣步驟，采樣量，保存液、消化液的使用體積，滅活方式等。描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性。

5.【檢驗方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽性質(zhì)控品與待測樣本同步進行核酸提取操作。明確各適用機型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍，作為試驗有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

6.【陽性判斷值】

簡述陽性判斷值確定的方法，包括研究人群特征、研究樣本量和統(tǒng)計分析方法等。

7.【檢驗結(jié)果的解釋】

通過擴增曲線和Ct值進行結(jié)果陰陽性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽性、復(fù)測、無效等所有情形。

8.【檢驗方法的局限性】

8.1本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

8.2有關(guān)假陽性結(jié)果的可能性分析

8.2.1如果樣本在運輸、處理過程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

8.2.2試驗環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

8.2.3試驗過程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

8.3有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

8.3.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運、儲存及處理、樣本中病原體含量過低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

8.3.2該病原體待測靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?dǎo)致假陰性結(jié)果；

8.3.3未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

8.4本試劑盒不能區(qū)分真菌污染、定植和感染，應(yīng)結(jié)合臨床癥狀和其他檢查結(jié)果綜合判斷。

9.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

簡述試劑性能指標(biāo)和研究情況，建議包含：參考品的符合性、準(zhǔn)確性、檢出限、包容性、精密度、分析特異性、臨床試驗等。

10.【注意事項】

10.1試劑保存運輸及使用過程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測過程操作不規(guī)范等，請嚴(yán)格按照說明書操作。

10.2生物安全防護相關(guān)內(nèi)容

10.3避免實驗室污染的措施

三、參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局. 關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告: 國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號[Z].

[2] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則: 國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第17號[Z].

[3] 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心.定性檢測試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則: 國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心公告2022年第36號[Z].

[4] 國家藥品監(jiān)督管理局 國家衛(wèi)生健康委員會. 醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范：國家藥監(jiān)局 國家衛(wèi)生健康委關(guān)于發(fā)布醫(yī)療器械臨床試驗質(zhì)量管理規(guī)范的公告2022年第28號[Z].

[5] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 接受醫(yī)療器械境外臨床試驗數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則：食品藥品監(jiān)管總局關(guān)于發(fā)布接受醫(yī)療器械境外臨床試驗數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則的通告2018年第13號[Z].

[6] 國家藥品監(jiān)督管理局. 體外診斷試劑臨床試驗技術(shù)指導(dǎo)原則: 國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第72號[Z].

[7] 國家藥品監(jiān)督管理局. 使用體外診斷試劑境外臨床試驗數(shù)據(jù)的注冊審查指導(dǎo)原則: 國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第95號[Z].