附件：流行性感冒病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版）（2024年第1號(hào)）.doc

流行性感冒病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)審查
指導(dǎo)原則（2023年修訂版）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)流行性感冒病毒（以下簡稱流感病毒）核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)流感病毒核酸檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評(píng)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR法，對(duì)人口咽拭子、鼻咽拭子、鼻拭子等呼吸道分泌物樣本中的流感病毒核酸進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑。

對(duì)于采用其他方法學(xué)或其他樣本類型的流感病毒核酸檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人可參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)，并補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料。

流感病毒屬于正粘病毒科，是單股、負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白不同可分為甲、乙、丙、丁（或A、B、C、D）四型。甲型流感病毒根據(jù)病毒表面的血凝素（hemagglutinin，HA）及神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA）的蛋白結(jié)構(gòu)和基因特異性，可分為多種亞型。目前發(fā)現(xiàn)的HA和NA分別有18個(gè)（H1-18）和11個(gè)（N1-11）亞型。乙型流感病毒分為Victoria系和Yamagata系。目前引起流感季節(jié)性流行的病毒是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。

流感病毒核酸檢測(cè)試劑可用于流感的實(shí)驗(yàn)室診斷，甲型流感病毒各亞型的核酸檢測(cè)試劑還可用于區(qū)分季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒。　　

本指導(dǎo)原則適用于流感病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申請(qǐng)和變更注冊(cè)申請(qǐng)的情形。本指導(dǎo)原則僅針對(duì)流感病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1.產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如甲型/乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2.其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測(cè)流程。提供不同適用機(jī)型的檢測(cè)通量，即一次檢測(cè)最多可檢測(cè)的樣本數(shù)。提供核酸提?。ㄊ止ず妥詣?dòng)提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時(shí)間，以及檢測(cè)全過程所需的時(shí)間。不同檢測(cè)流程，分別提供最少和最多檢測(cè)樣本量下的檢測(cè)時(shí)間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測(cè)原理，檢測(cè)靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。

預(yù)期用途中明確產(chǎn)品檢測(cè)的靶基因，需選擇保守性和特異性的基因，同時(shí)還應(yīng)考慮基因的擴(kuò)增效率。檢測(cè)靶基因的選擇應(yīng)提供相關(guān)指南或文獻(xiàn)，并分析所檢測(cè)基因的靈敏度和特異性是否符合臨床需求。

（三）非臨床資料

1. 產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。

甲型、乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑已有國家參考品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家參考品的相關(guān)要求，并使用國家參考品對(duì)三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)。

如果有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2. 分析性能研究

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

如申報(bào)產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要提交在不同機(jī)型上進(jìn)行性能評(píng)估的研究資料。如申報(bào)產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對(duì)各包裝規(guī)格間的差異進(jìn)行分析或驗(yàn)證。對(duì)于適用的不同樣本類型應(yīng)分別進(jìn)行分析性能研究。

分析性能評(píng)估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的流行性感冒病毒陽性樣本，應(yīng)采用科學(xué)合理的方法確定其陰陽性和濃度水平，并提交具體的試驗(yàn)資料。分析性能評(píng)估用樣本一般應(yīng)為真實(shí)樣本或病毒培養(yǎng)物，如涉及稀釋后檢測(cè)，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)?；蚣俨《具M(jìn)行分析性能評(píng)估。對(duì)于各項(xiàng)性能中采用的樣本，在下述各項(xiàng)性能研究資料中分別提供樣本信息列表。

2.1樣本穩(wěn)定性

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應(yīng)對(duì)樣本穩(wěn)定性進(jìn)行研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，加入不同裂解液/消化液的樣本，滅活處理后的樣本，研究內(nèi)容包括冷藏保存時(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數(shù)等。

如產(chǎn)品適用拭子、痰液等不同的樣本類型，因其中干擾物質(zhì)存在較大差異，可能對(duì)病毒RNA降解的影響不同，建議對(duì)每種樣本類型均進(jìn)行穩(wěn)定性研究。

如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測(cè)，還需對(duì)核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

2.2適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型。

2.3準(zhǔn)確度

采用申報(bào)試劑與臨床診斷或已上市產(chǎn)品，同時(shí)檢測(cè)臨床樣本，比較檢測(cè)結(jié)果之間的一致性程度，進(jìn)行申報(bào)試劑的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)。

樣本應(yīng)選擇符合樣本穩(wěn)定性的預(yù)期人群樣本。研究應(yīng)納入一定數(shù)量的陰性和陽性樣本，并注意包含一定數(shù)量的陽性判斷值附近的樣本和干擾樣本。

2.4企業(yè)參考品驗(yàn)證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.5精密度

應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評(píng)價(jià)。

精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測(cè)，具體方案可參考性能評(píng)價(jià)相關(guān)文件進(jìn)行。

應(yīng)采用臨床樣本或病毒培養(yǎng)物進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、檢出限水平樣本、中/強(qiáng)陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/p>

陰性樣本：不含待測(cè)物或待測(cè)物濃度為零時(shí)，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。

檢出限水平樣本：檢出限水平樣本陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

中/強(qiáng)陽性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽性，陽性符合率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。

2.6檢出限

2.6.1檢出限的確定

將不同來源的至少3份流感病毒樣本分別梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度重復(fù)檢測(cè)不少于20次，將具有95%陽性檢出率的濃度水平作為檢出限。申請(qǐng)人可采用半數(shù)組織感染量測(cè)定法（TCID50）進(jìn)行濃度確認(rèn)，以TCID50/mL作為毒株濃度的表示方式；也可采用空斑形成單位（PFU）進(jìn)行濃度確認(rèn)，以PFU/mL作為毒株濃度的表示方式。除此之外，申請(qǐng)人還應(yīng)采用數(shù)字PCR、標(biāo)準(zhǔn)曲線等方法進(jìn)行毒株核酸濃度的確認(rèn)，以copies/mL或國際單位作為毒株核酸濃度的表示方式。

在進(jìn)行檢出限建立時(shí)申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢測(cè)流感病毒的類型及其亞型分別進(jìn)行研究，甲型流感病毒應(yīng)至少包括H1N1、H3N2亞型，乙型流感病毒應(yīng)包括Victoria系和Yamagata系。

2.6.2檢出限的驗(yàn)證

另外選擇具有時(shí)間和區(qū)域特征性的至少3個(gè)臨床樣本或病毒培養(yǎng)物在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到95%陽性檢出率。

檢出限驗(yàn)證的樣本型別應(yīng)覆蓋甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1和H7N9亞型，乙型流感Yamagata系和Victoria系以及近3年內(nèi)我國出現(xiàn)的新的流行亞型，具體可參考中國國家流感中心發(fā)布的流感監(jiān)測(cè)報(bào)告。

應(yīng)提供詳細(xì)的病毒滴度/濃度的確定方法，同時(shí)應(yīng)詳細(xì)描述病毒樣本的確認(rèn)方法及驗(yàn)證結(jié)果。

2.7包容性

2.7.1采用生物信息學(xué)方法對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)的包容性進(jìn)行研究，研究應(yīng)覆蓋已公布的申報(bào)試劑聲稱檢測(cè)范圍內(nèi)的流感病毒核酸序列。

2.7.2驗(yàn)證樣本型別應(yīng)覆蓋甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1和H7N9亞型，乙型流感病毒Yamagata系和Victoria系以及近3年內(nèi)出現(xiàn)的新的流行亞型。每種亞型應(yīng)使用具有時(shí)間和區(qū)域特征性的不同來源的多例陽性樣本（臨床樣本或病毒培養(yǎng)物）進(jìn)行研究，應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗(yàn)證。注意包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復(fù)。

申請(qǐng)人應(yīng)提供用于包容性驗(yàn)證的病毒株的來源、型別確認(rèn)、滴度或濃度確定等信息。

2.8分析特異性

2.8.1交叉反應(yīng)

用于流感病毒核酸檢測(cè)試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物。

建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106cfu/mL或更高，病毒為105pfu/mL或更高。

首先，應(yīng)在流感病毒不同類型和亞型間進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證；其次，采用其他的病原微生物進(jìn)行驗(yàn)證（見表1）。

申請(qǐng)人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。

2.8.2微生物干擾

申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床上容易與流感病毒合并感染的病原體以及流感病毒的不同類型或亞型，在高濃度的情況下對(duì)低濃度（例如檢出限濃度）被測(cè)類型或亞型流感病毒核酸檢測(cè)的影響。

2.8.3競爭性干擾

申請(qǐng)人應(yīng)充分考慮臨床上常見存在的流感病毒不同類型或亞型混合感染情況，評(píng)價(jià)高濃度分析物對(duì)低濃度分析物檢測(cè)的影響。建議申請(qǐng)人結(jié)合申報(bào)試劑的反應(yīng)模式，使用一種類型或亞型最低檢測(cè)限濃度的流感病毒和另一種類型或亞型高濃度流感病毒評(píng)估競爭性干擾，競爭性感染的流感病毒型別組合建議為同一反應(yīng)體系內(nèi)常見不同類型或亞型混合感染的流感病毒。競爭性干擾試驗(yàn)可與最低檢測(cè)限、重復(fù)性或其他干擾試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。

2.8.4干擾物質(zhì)

應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對(duì)可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)包含檢出限水平和陰性水平在內(nèi)的常見亞型流感病毒樣本。對(duì)結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct值差異。檢測(cè)的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。

2.9核酸（RNA）提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測(cè)之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對(duì)配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，必要時(shí)可考慮與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對(duì)。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測(cè)試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗(yàn)證。

2.10反應(yīng)體系

2.10.1樣本采集和處理

2.10.1.1樣本采集方式的選擇

2.10.1.2采樣拭子及樣本保存液的選擇：對(duì)拭子頭和拭子桿的材質(zhì)要求。明確保存液或裂解液的成分、濃度或備案號(hào)以及使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗(yàn)證檢出限和重復(fù)性。

2.10.1.3樣本處理方式的選擇：研究產(chǎn)品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學(xué)滅活，化學(xué)滅活部分應(yīng)對(duì)常見的消毒劑的適用性進(jìn)行研究。研究樣本前處理方式，包括對(duì)不同樣本類型的離心條件的確定研究等。

2.10.2核酸提取和反應(yīng)體系

研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測(cè)靈敏度。

提交不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。

不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

3. 穩(wěn)定性研究

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4. 陽性判斷值研究

陽性判斷值一般為申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)病毒核酸陽性的Ct值。陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同年齡、地域、不同時(shí)間和感染階段等因素，盡量納入含有干擾物質(zhì)或其他易引起交叉反應(yīng)病原體的樣本。建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對(duì)申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行陽性判斷值研究。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。如采用其他方法對(duì)陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說明這種方法的合理性。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。
如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對(duì)各樣本類型進(jìn)行陽性判斷值的驗(yàn)證。

提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機(jī)構(gòu)、檢測(cè)結(jié)果等信息。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對(duì)比篩選試驗(yàn)資料、生產(chǎn)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對(duì)和功能性試驗(yàn)等方式，對(duì)病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評(píng)價(jià)，其中序列比對(duì)包括與已公布流感病毒序列的比對(duì)，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對(duì)；功能性試驗(yàn)包括對(duì)不同來源、不同滴度/濃度的流感病毒核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測(cè)。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗(yàn)等。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對(duì)其純度、濃度、功能性等詳細(xì)驗(yàn)證資料。

5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對(duì)酶活性、功能性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。

5.1.4質(zhì)控品

試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測(cè)的靶序列，可采用假病毒等制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測(cè)的全過程，以對(duì)整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗(yàn)資料，對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。

5.1.5內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對(duì)照，可對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請(qǐng)人需對(duì)內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對(duì)靶基因檢測(cè)造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對(duì)待測(cè)樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。

5.1.6企業(yè)參考品

該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本，或使用病毒培養(yǎng)物加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

陽性參考品：陽性參考品應(yīng)設(shè)置不同的濃度水平，并應(yīng)根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢測(cè)流感病毒的類型及亞型情況分別設(shè)置，甲型流感病毒應(yīng)至少包括H1N1、H3N2亞型；乙型流感病毒應(yīng)包括Victoria系和Yamagata系。

陰性參考品：主要涉及對(duì)交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況，納入正常臨床樣本、含除待測(cè)類型流感病毒外其他類型流感病毒的樣本及含有冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等其他病原體的樣本。

檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。應(yīng)針對(duì)申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢出的不同類型常見亞型流感病毒分別設(shè)置。

重復(fù)性參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。應(yīng)針對(duì)申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢出的不同類型常見亞型流感病毒分別設(shè)置。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。

（四）臨床評(píng)價(jià)資料

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)

申請(qǐng)人應(yīng)選擇至少3家備案的醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)。考慮到流感病毒不同病毒株的區(qū)域性特征較強(qiáng)，建議申請(qǐng)人在國內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本具有一定的區(qū)域代表性；臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有呼吸道疾患診療、病毒分離培養(yǎng)鑒定方法或分子生物學(xué)方法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)體外診斷試劑（以下稱考核試劑）和對(duì)比方法都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。

2.臨床試驗(yàn)適用人群和樣本類型

臨床試驗(yàn)應(yīng)按照入組標(biāo)準(zhǔn)納入受試者，應(yīng)選擇具有流感癥狀/體征(如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉疼痛、發(fā)燒、頭疼或肌痛等)、流感相似癥狀或有密切接觸史的人群作為適用人群，應(yīng)盡量覆蓋各個(gè)年齡段人群。對(duì)于通用型甲型、乙型流感病毒核酸檢測(cè)試劑，臨床試驗(yàn)人群應(yīng)至少涵蓋近3年主要流行亞型，可參考中國國家流感中心的流感監(jiān)測(cè)報(bào)告。

對(duì)于甲型流感病毒新亞型試劑，臨床試驗(yàn)所選擇病例除甲型流感病毒新亞型感染者及密切接觸者外，還應(yīng)包括其他當(dāng)年流行的季節(jié)性流感病毒感染患者、非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者等。其臨床試驗(yàn)應(yīng)能夠體現(xiàn)該產(chǎn)品對(duì)甲型流感病毒新亞型檢測(cè)的特異性。

臨床試驗(yàn)應(yīng)對(duì)考核試劑聲稱的各種樣本類型分別進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)采用臨床原始樣本進(jìn)行臨床試驗(yàn)，臨床樣本的處理和保存等應(yīng)分別滿足考核試劑及對(duì)比試劑說明書的相關(guān)要求。

3.臨床試驗(yàn)對(duì)比方法

3.1 對(duì)于已有同類產(chǎn)品上市的試劑，選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用考核試劑與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。

3.2 對(duì)于無同類產(chǎn)品上市的新亞型試劑，臨床試驗(yàn)對(duì)比方法應(yīng)以核酸序列測(cè)定為主，輔以病毒分離培養(yǎng)鑒定。其中，用于核酸序列測(cè)定的引物應(yīng)不同于考核試劑的引物。

3.3對(duì)于無同類產(chǎn)品上市的新樣本類型試劑，在充分考慮樣本類型差異的前提下，臨床試驗(yàn)對(duì)比方法可選擇3.2小節(jié)的對(duì)比方法，也可選擇樣本類型等具有可比性的已上市同類產(chǎn)品。

4.臨床試驗(yàn)最低樣本量

4.1 對(duì)于已有同類產(chǎn)品上市的試劑

建議采用單組目標(biāo)值法進(jìn)行最低樣本量的估算，通過陽性和陰性符合率分別估算陽性和陰性樣本量，并詳細(xì)描述各參數(shù)的確定依據(jù)。陽性和陰性符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議不低于90%。當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)P接近100%時(shí)，該樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

如適用于多種樣本類型，在滿足總陽性和總陰性樣本量分別滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)估算的前提下，每種樣本類型的陽性和陰性樣本例數(shù)，應(yīng)均不少于70例。

4.2 對(duì)于無同類產(chǎn)品上市的新亞型試劑

以核酸序列測(cè)定作為對(duì)比方法時(shí)，可參考4.1小節(jié)樣本量的估算方法。

以病毒分離培養(yǎng)鑒定作為對(duì)比方法時(shí)，建議采用抽樣調(diào)查公式進(jìn)行最低樣本量的估算，通過臨床靈敏度和特異度分別估算陽性和陰性樣本量，并詳細(xì)描述各參數(shù)的確定依據(jù)。臨床靈敏度的預(yù)期值建議不低于95%，臨床特異度預(yù)期值的設(shè)定應(yīng)有充分依據(jù)。

4.3 對(duì)于無同類產(chǎn)品上市的新樣本類型試劑

如選擇3.2小節(jié)所述對(duì)比方法，可參考4.2小結(jié)樣本量的估算方法。

如選擇樣本類型具有可比性的已上市同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，可參考4.1小節(jié)樣本量的估算。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種方法的結(jié)果，評(píng)價(jià)陽性符合率/陰性符合率、靈敏度/特異度，并計(jì)算相應(yīng)的95%置信區(qū)間。不同樣本類型和不同對(duì)比方法均應(yīng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)、年齡分布情況進(jìn)行分類匯總。

對(duì)兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用臨床參考標(biāo)準(zhǔn)或臨床上普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。

6.其他

對(duì)于已批準(zhǔn)上市的甲型流感病毒核酸（通用型）檢測(cè)試劑，如在其注冊(cè)證有效期內(nèi)出現(xiàn)了甲流病毒新亞型的暴發(fā)流行，建議申請(qǐng)人對(duì)甲流病毒新亞型進(jìn)行臨床試驗(yàn)，分別對(duì)來自甲型流感病毒新亞型感染、其他常見的流感病毒亞型（如當(dāng)年流行的季節(jié)性甲型流感病毒）及非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者的新鮮樣本進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)產(chǎn)品預(yù)期用途覆蓋病毒亞型的變化提出變更注冊(cè)申請(qǐng)，按照法規(guī)要求提交臨床試驗(yàn)等資料。

7.境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的認(rèn)可

境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)符合《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》和《使用體外診斷試劑境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的注冊(cè)審查指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。應(yīng)提交完整的臨床試驗(yàn)方案、報(bào)告和倫理審查意見，以及該數(shù)據(jù)適用于中國患者人群的論證資料、境內(nèi)外臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異的對(duì)比資料和臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理差異對(duì)于臨床試驗(yàn)結(jié)果影響的論證資料。

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)上述臨床試驗(yàn)技術(shù)審評(píng)要求，論證境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的充分性。

8.臨床試驗(yàn)方案

臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的對(duì)比試劑應(yīng)完全一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，考核試劑的樣本類型不應(yīng)超越對(duì)比試劑對(duì)樣本類型的檢測(cè)要求，如果選擇了對(duì)比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應(yīng)選擇其他合理方法對(duì)額外的樣本類型進(jìn)行驗(yàn)證。

9.臨床試驗(yàn)小結(jié)和報(bào)告

臨床試驗(yàn)小結(jié)和報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。

（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。流感病毒核酸檢測(cè)試劑說明書編寫應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1.【預(yù)期用途】

1.1試劑盒用于定性檢測(cè)人口咽拭子、鼻咽拭子、鼻拭子等呼吸道分泌物樣本（根據(jù)具體情況描述）中X型流感病毒RNA（根據(jù)實(shí)際情況描述）。

1.2簡單介紹流感病毒的病原學(xué)特征、流行病學(xué)特征以及臨床表現(xiàn)和現(xiàn)有診斷方法等。

1.3強(qiáng)調(diào)本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不得作為臨床診斷的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)病情進(jìn)行綜合分析。

2.【檢驗(yàn)原理】

簡述產(chǎn)品的核酸提取和技術(shù)原理，介紹引物及探針設(shè)計(jì)/對(duì)照品（質(zhì)控品）設(shè)置及熒光信號(hào)標(biāo)記等。明確內(nèi)標(biāo)基因名稱及其作用。如采用了防污染措施，進(jìn)行簡要描述。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號(hào)及注冊(cè)證號(hào)、備案號(hào)等信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性等，明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期等信息。

5.【適用儀器】

注明所有適用儀器的型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【樣本要求】

描述樣本采集和處理方式，包括采樣步驟，適用的拭子材質(zhì)，保存液、消化液的使用體積，滅活方式等。描述樣本及核酸提取液的保存穩(wěn)定性。

7.【檢驗(yàn)方法】

明確核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積，陰、陽性質(zhì)控品與待測(cè)樣本同步進(jìn)行核酸提取操作。明確各適用機(jī)型的反應(yīng)參數(shù)設(shè)置。明確質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果Ct值范圍，作為實(shí)驗(yàn)有效性的標(biāo)準(zhǔn)。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通過擴(kuò)增曲線和Ct值進(jìn)行結(jié)果陰陽性的判斷，列明結(jié)果陰性、陽性、復(fù)測(cè)、無效等所有情形。

9.【檢驗(yàn)方法局限性】

9.1本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，對(duì)患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

9.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理、樣本中病毒滴度過低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.2.2流感病毒待測(cè)靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

9.2.3對(duì)于突發(fā)的新型流感病毒，其檢測(cè)的最適樣本類型及感染后的最佳采樣時(shí)間可能尚未確認(rèn)，因此，在同一患者分次、多部位采集樣本會(huì)降低假陰性結(jié)果的可能性。

9.2.4未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子，可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

9.3有關(guān)假陽性結(jié)果的可能性分析

9.3.1如果樣本在運(yùn)輸、處理過程中發(fā)生交叉污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

9.3.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境有PCR產(chǎn)物等氣溶膠污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

9.3.3 實(shí)驗(yàn)過程中使用的耗材、設(shè)備等受污染，則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

9.3.4取標(biāo)本期間，接種減毒活疫苗的患者可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)試劑檢測(cè)結(jié)果呈陽性

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 詳述以下性能指標(biāo)：

10.1國家參考品和企業(yè)參考品的符合情況。對(duì)于甲型流感通用型核酸檢測(cè)試劑，應(yīng)列出所有驗(yàn)證過的甲型流感病毒各亞型病毒株的信息。

10.2檢出限：簡要介紹評(píng)價(jià)方法、所用樣本情況以及評(píng)價(jià)結(jié)果。

10.3對(duì)包容性的研究情況進(jìn)行總結(jié)。對(duì)于甲型流感通用型核酸檢測(cè)試劑，應(yīng)列出所有驗(yàn)證過的甲型流感病毒各亞型病毒株的信息。

10.4精密度：對(duì)精密度的研究情況進(jìn)行總結(jié)。

10.5分析特異性

10.5.1甲型流感病毒各亞型間的交叉反應(yīng)驗(yàn)證：針對(duì)甲型流感病毒亞型檢測(cè)的試劑盒，則應(yīng)對(duì)較常見的除目的基因外的其他亞型進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證并對(duì)結(jié)果進(jìn)行合理分析；

10.5.2交叉反應(yīng)：詳述交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類，及有/無交叉反應(yīng)的濃度水平。

10.5.3干擾試驗(yàn)：說明驗(yàn)證的干擾物質(zhì)種類及有/無干擾反應(yīng)的濃度水平。

10.6臨床試驗(yàn)：簡要介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項(xiàng)】

11.1臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

11.2 試劑保存運(yùn)輸及使用過程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運(yùn)輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測(cè)過程操作不規(guī)范等，請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書操作。因拭子等樣本采集過程及病毒感染過程本身的特點(diǎn)，可能存在采集到的樣本量不足等原因帶來的假陰性結(jié)果，應(yīng)結(jié)合臨床其他診療信息綜合判斷，必要時(shí)復(fù)測(cè)。

11.3避免實(shí)驗(yàn)室污染的措施

11.4生物安全防護(hù)相關(guān)內(nèi)容

三、參考文獻(xiàn)：

[1]國家市場監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法：國家市場監(jiān)督管理總局令第48號(hào)[Z].

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告：國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號(hào)[Z].

[3]國家藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則：國家藥品監(jiān)督管理局2021年第72號(hào)[Z].

[4]國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心.定性檢測(cè)體外診斷試劑分析性能評(píng)估注冊(cè)審查指導(dǎo)原則：國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心2022年第36號(hào)[Z].

[5]國家衛(wèi)生健康委員會(huì)、國家中醫(yī)藥管理局.流行性感冒診療方案（2020）

[6]中國疾病預(yù)防控制中心.中國流感疫苗預(yù)防接種技術(shù)指南（2022-2023）