附件：人表皮生長因子受體（EGFR）突變基因檢測試劑（PCR法）注冊技術審查指導原則（2018年第36號）.doc

人表皮生長因子受體（EGFR）突變基因檢測
試劑（PCR法）注冊技術審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對人表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，以下簡稱為EGFR）突變基因檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門對注冊申報資料的技術審評提供參考。

本指導原則是針對EGFR突變基因檢測試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細闡明理由，并對其科學合理性進行驗證，提供詳細的研究資料和驗證資料，相關人員應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內容也將適時進行調整。

一、范圍

本指導原則所述EGFR突變基因檢測試劑主要是指基于核酸聚合酶鏈式反應（PCR法），以EGFR突變基因為檢測目標，體外定性檢測細胞學樣本、病理組織學樣本、外周血樣本或其他體液樣本提取的核酸組分中的目標基因序列。

EGFR是原癌基因c-erbB1的表達產(chǎn)物，是表皮生長因子受體（HER）家族成員之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四個分子構成，在細胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。

EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，該受體激酶域激活與癌細胞增殖、轉移和凋亡等多種信號傳導通路有關。肺腺癌患者EGFR基因敏感突變的亞裔人群陽性率要高于高加索人群。EGFR突變主要發(fā)生在胞內酪氨酸激酶（TK）區(qū)域的前四個外顯子上（18～21），目前發(fā)現(xiàn)的TK區(qū)域突變有30多種。缺失突變主要發(fā)生在外顯子19上，最常見的是del E746-A750，替代突變最常見的是發(fā)生在外顯子21上的L858R，復制或插入突變發(fā)生在外顯子20上。其中外顯子20上的T790M替代突變?yōu)橐淮鶨GFR酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI）的耐藥突變。此外，還有許多類型的突變臨床意義尚不明確。EGFR作為癌癥治療的分子靶標受到普遍關注，并已陸續(xù)開發(fā)出了吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）和?？颂婺幔↖cotinib）等TKI。

腫瘤組織樣本仍是獲取腫瘤基因相關信息的主要來源，但大部分晚期肺癌患者已失去手術機會或由于種種原因不能獲取腫瘤組織樣本。研究結果表明，實體腫瘤患者的外周血中存在來源于凋亡、壞死的腫瘤細胞的游離DNA。對晚期肺癌患者，在不能獲取肺癌組織樣本時，可以選擇外周血樣本進行EGFR突變基因檢測；如可以獲得病理組織時，建議以病理組織提取檢測結果為優(yōu)先考慮。當腫瘤組織難以獲取時，外周血樣本可以是EGFR突變基因檢測方式的重要補充手段之一。

本指導原則相關技術要求主要基于熒光探針PCR方法的EGFR突變基因試劑進行評價，如基于熒光探針PCR原理的同類試劑不適用本指導原則部分相關技術要求，申請人應闡述不適用的理由并結合自身產(chǎn)品特性提出科學合理的評價方法，申請人可根據(jù)實際產(chǎn)品特性選擇適合的方法或結合本指導原則補充需要的評價和驗證。對于其他分子生物學檢測技術，如適用，申請人可參考本指導原則部分相關技術要求進行性能評價。

本指導原則適用于進行首次注冊申報和相關許可事項變更的產(chǎn)品。本指導原則不適用于EGFR基因拷貝數(shù)變化檢測、核酸序列測定、免疫組化技術、熒光原位雜交法。

EGFR病理組織學樣本和外周血樣本檢測中存在較大差異，在參考品及質控品設置、分析性能評估、臨床評價要求、產(chǎn)品技術要求、產(chǎn)品說明書等多個方面均存在不同要求，為便于申請人對指導原則進行理解，故將產(chǎn)品預期用途用于組織學樣本檢測和預期用途用于外周血樣本檢測試劑申報要求進行分開說明。需要說明的是，申請人申報產(chǎn)品如同時包括外周血樣本和組織學樣本，對于相同部分，申請人可合并提交注冊申報資料。如原注冊產(chǎn)品預期用途中僅為組織樣本類型，需增加外周血樣本類型，考慮到外周血樣本類型與組織樣本類型中EGFR片段長度，樣本中突變比例等差異，申請人除完成許可事項變更申報資料要求，還應提交擴增反應體系性能評價、外周血分析性能評價、外周血樣本保存及處理、臨床評價等研究資料。

申報試劑作為腫瘤個體化伴隨檢測試劑，主要用于人非小細胞肺癌（NSCLC）個體化治療。如申請人將EGFR申報試劑運用于其他癌癥類型的研究，申請人可參照本指導原則適用的研究體系，但應強調的是，腫瘤藥物個體化檢測試劑與治療藥物具有關聯(lián)性，申請人需結合EGFR突變基因檢測與治療藥物預期用途所限定的癌癥類型進行聯(lián)合評價研究。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

1.產(chǎn)品預期用途。描述產(chǎn)品的預期用途，與預期用途相關的臨床背景情況。EGFR突變基因與不同人群之間的關聯(lián)，不同藥物對不同EGFR突變類型的患者治療效果描述。如適應癥的發(fā)生率、易感人群等，相關的臨床或實驗室診斷方法等。

2.產(chǎn)品描述。描述產(chǎn)品所采用的技術原理，主要原材料的來源及制備方法，主要生產(chǎn)工藝過程，質控品、校準品的制備方法情況。

3.有關生物安全性方面說明。由于體外診斷試劑中的主要原材料可能是由各種動物、病原體、人源的組織和體液等生物材料經(jīng)處理或者添加某些物質制備而成，人源性材料須對有關傳染?。℉IV、HBV、HCV等）病原體檢測予以說明，并提供相關的證明文件。其他動物源及微生物來源的材料，應當提供相應的說明文件，證明其在產(chǎn)品運輸、使用過程中對使用者和環(huán)境是安全的，并對上述原材料所采用的滅活等試驗方法予以說明。

4.有關產(chǎn)品主要研究結果的總結和評價。

5.其他。包括同類產(chǎn)品在國內外批準上市的情況。相關產(chǎn)品所采用的技術方法及臨床應用情況，申請注冊產(chǎn)品與國內外同類產(chǎn)品的異同等。對于新研制的體外診斷試劑產(chǎn)品，需要提供被測物與預期適用的臨床適應癥之間關系的文獻資料。

（二）主要原材料的研究資料

此類產(chǎn)品的主要原材料應包括EGFR突變基因檢測試劑的所有主要組成成分，如引物、探針、酶、反應緩沖液、提取成分（如包含）等。如為申請人自行研制的主要原材料，申請人應對EGFR目的基因序列確定、引物和探針選擇、酶的選擇和驗證等實驗過程予以詳述；并提供對各主要原材料的性能研究資料，如：外觀、純度、蛋白濃度、功能性研究等。制備完成的原料成品應進行質量檢驗以確認其符合標準要求，整個生產(chǎn)工藝應穩(wěn)定可控。如為申請人外購主要原材料，應詳述每一原材料外購方來源，提交外購方出具的原材料性能指標及質量控制資料，并詳述申請人對外購主要原材料的各指標質量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細依據(jù)。

1.核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關的驗證資料。

2.PCR組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質量標準及實驗研究資料，主要包括以下內容：

2.1脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；應提交對其純度、濃度、保存穩(wěn)定性等的驗證資料。

2.2引物

應優(yōu)化每一單一突變基因專用引物的相對濃度，避免多個核酸靶序列同時擴增時出現(xiàn)相互影響和競爭。引物設計時，應對反應體系中所有引物進行篩選，避免引物二聚體形成。為保證每一靶序列檢測準確性，EGFR檢測試劑中每一突變基因引物的濃度必須進行優(yōu)化，應根據(jù)靶序列突變性質、C+G含量等確定每一突變基因引物的長度和濃度，且單一引物最適濃度還應考慮所有引物濃度之間的相互影響。由一定數(shù)量的堿基構成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對引物的分子量、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等的驗證資料。如為外購，還應提供合成機構出具的合成產(chǎn)物的質檢證明，如PAGE結果或高效液相色譜法（HPLC）分析圖譜。應對引物結構進行對比，引物擴增區(qū)段不應有重復序列。

2.3探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)PAGE或其他適宜方法純化，在5'-端（和/或3'-端）進行標記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化，純度應達到HPLC純。應提供合成機構出具的合成產(chǎn)物質檢證明，如HPLC分析圖譜，應對探針的分子量、純度及標記的熒光基團進行核實，并進行功能性試驗驗證。

2.4酶

DNA聚合酶，應具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。逆轉錄酶，具逆轉錄酶活性，無核酸內切酶活性。應對酶活性進行合理驗證。

3.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應無脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。

4.企業(yè)內部參考品

企業(yè)內部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測值可溯源的重要構成之一。參考品研究應包括原料選擇、制備過程、定值研究、評價指標、統(tǒng)計學分析等。申請人應對內部參考品的來源、基因序列設置等信息進行精確的實驗驗證，并提供參考品溯源過程的測量程序或參考方法的相關信息及詳細的驗證資料。申請人應根據(jù)產(chǎn)品性能驗證實際情況自行設定內部參考品，陽性參考品應著重考慮EGFR突變基因型別要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應）的驗證情況。如該類產(chǎn)品有國家標準品，在不低于國家參考品要求前提下，申請人可以結合實際情況設置合理的內部參考品。具體要求如下：

4.1組織樣本參考品設置要求

4.1.1陽性參考品

陽性參考品中常見基因突變位點建議采用臨床樣本提取的DNA儲備液或細胞系作為原料。其他突變位點可采用DNA儲備液、細胞系或EGFR突變擴增產(chǎn)物模擬樣本作為原料。如采用EGFR突變擴增產(chǎn)物作為陽性參考品，應盡可能模擬真實樣本，需要對樣本基質進行基質效應研究。

試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點均應設置相應的陽性參考品，每個突變位點設置不同突變百分率梯度，其中至少應包括高濃度和低濃度陽性參考品。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法（如測序方法或數(shù)字化PCR等）進行確認，并明確接受標準。

4.1.2陰性參考品

可采用經(jīng)確認無相應靶突變序列的DNA儲存液。如野生型人基因組DNA，HER家族DNA等。

4.1.3檢測限參考品

檢測限參考品的原料要求參考陽性參考品，需包括所有的突變類型。在進行最低檢測限性能評估時，應設置多個梯度，主要從擴增反應終體系總核酸濃度和突變序列所占百分率兩個方面進行評價，建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。

4.1.4精密度參考品

精密度參考品原料要求參考陽性參考品，需至少包括弱陽性、中或強陽性水平的精密度驗證，中/強陽性精密度參考品以常見突變類型或理論上較難測得的突變序列為主；同時設置陰性參考品精密度驗證。

4.2外周血樣本參考品設置要求

4.2.1陽性參考品

陽性參考品中常見突變基因位點建議采用臨床樣本提取的DNA儲備液或細胞系作為原料?？紤]外周血中EGFR突變基因DNA含量較低，其他突變位點可以采用DNA儲備液或細胞系或EGFR突變基因擴增產(chǎn)物模擬樣本，樣本基質應為人血漿或人工模擬樣本，使用人血漿時，應提前確認人血漿中DNA背景濃度；使用人工模擬樣本時，應盡可能模擬真實樣本，并對模擬樣本進行基質效應研究。

試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點均應設置相應的陽性參考品，每個突變位點設置不同突變百分率梯度，其中需至少包括弱陽性參考品。陽性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法（如測序方法或數(shù)字PCR等）進行確認，并明確接受標準。

4.2.2陰性參考品

可采用經(jīng)確認無相應靶突變序列的DNA儲存液。如野生型人基因組DNA，HER家族其他DNA等。

4.2.3檢測限參考品

檢測限參考品的原料要求參考陽性參考品，需包括所有的突變類型。在進行最低檢測限性能評估時，應設置多個梯度，建議采用95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標準。

4.2.4精密度參考品

精密度參考品原料要求參考陽性參考品，需至少包括弱陽性、中或強陽性水平的精密度驗證，中/強陽性精密度參考品以常見突變類型或理論上較難測得的突變序列為主，同時設置陰性參考品精密度驗證。

5.試劑盒內對照品（質控品）

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒對照品來實現(xiàn)，質控體系需考慮對樣本核酸分離/純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴增反應抑制物（管內抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結果進行合理的質量控制。對照品可采用質粒、假病毒或臨床樣本的核酸提取液等進行配置。申報資料應對試劑盒對照品有關原料選擇、制備、定值過程等試驗資料詳細說明。申請人應視申報產(chǎn)品具體情況設置合理的試劑盒對照品（質控品），試劑盒質控體系主要考慮以下幾方面要求：

5.1陽性對照品（質控品）

申請人應對各陽性對照品（質控品）的Ct值提出明確的范圍要求。如樣本反應管內可以覆蓋多種突變序列的檢測（分型或不分型），相應的陽性對照管應選擇較常見突變序列或理論上較難測得的突變序列作為陽性對照。

5.2陰性對照

陰性對照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白對照，對交叉污染導致的假陽性結果進行質控。陰性對照品應參與樣本核酸的平行提取。

5.3內對照（內標）

內對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，申請人應對內對照（內標）的引物、探針和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料應能對反應體系涉及到的基本內容，如：臨床樣本用量、試劑用量、反應條件、質控體系設置、閾值循環(huán)數(shù)（Ct）值或臨界值確定等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應符合要求，原材料應混合均勻，配制過程應對pH、電導率、離子濃度等關鍵參數(shù)進行有效控制。主要包括以下內容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應原理介紹。

3.基因位點選擇、方法學特性介紹。

4.確定最佳PCR反應體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。

5.確定PCR反應各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。如反應體系相同，多個突變基因在相同反應條件下核酸擴增效率是否存在差別。

6.對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。應明確相同反應條件下，多個基因類型Ct是否相同。

7.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述。

8.如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。

（四）分析性能評估資料

分析性能評估是反映產(chǎn)品主要原材料選擇、生產(chǎn)工藝及反應體系等多方面因素設置是否合理的客觀評價指標。檢測試劑性能的研究方案應結合產(chǎn)品的反應原理、臨床用途、使用條件等綜合因素進行設計。性能研究應涵蓋產(chǎn)品研制階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內控標準、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。

1.病理組織學樣本類型評價要求

1.1最低檢測限

病理組織學樣本類型最低檢測限研究應包括擴增反應終體系中的突變序列百分率和申報產(chǎn)品反應體系中總核酸濃度兩個因素。

對于常見突變基因類型建議采用EGFR突變型的非小細胞肺癌（NSCLC）福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）和EGFR野生型的NSCLC FFPE樣本或細胞系制備DNA存儲液，對于罕見突變基因類型，建議采用DNA儲備液、細胞系或質粒與EGFR野生型NSCLC FFPE樣本制備DNA存儲液。

EGFR突變基因類型不同比例混合應注意的事項：每種突變基因類型樣本儲存液按照不同突變序列所占比例進行混合，結合PCR方法檢測靈敏度及病理組織學樣本類型，此處主要針對EGFR突變基因類型低比例情況進行配比，如從10%或8%起始按不同比例混合。至少應包括目標檢測限和檢測限上下至少各2個梯度比例范圍的研究資料，對于按不同比例混合后的不同樣本，建議采用數(shù)字化PCR或高通量測序法等方法檢測不同樣本的實際混合比例，并以實際混合比例作為EGFR突變基因的最低檢測限進行后續(xù)研究。同時，在EGFR突變基因不同比例研究過程中應設置EGFR野生型樣本作為空白對照。

確定反應體系總樣本加樣量以及反應體系中需要的DNA總量，申請人需說明每uL的DNA加樣量和總DNA濃度確定方法。在進行混合稀釋時，使用的FFPE樣本應與原混合配置樣本類型相同。建議申請人設計一個顯著高于反應體系最高DNA加樣量的DNA存儲濃度。在實際的EGFR不同突變比例下，進行不同梯度DNA濃度的檢測，不同DNA濃度各檢測至少3次，不同梯度DNA濃度范圍應涵蓋申報產(chǎn)品反應體系中設定的最高DNA濃度和最低DNA濃度。待確定組織中最低檢測限后，在組織樣本最低檢測限水平附近再額外檢測部分接近最低檢測限的樣本，確認最低檢測限DNA濃度。

1.1.1如申報產(chǎn)品適用不同的核酸提取方法，每種核酸提取方法應配套檢測試劑進行各突變基因類型最低檢測限驗證。

1.1.2如申報產(chǎn)品適用不同適用機型，每種適用機型應配套檢測試劑進行各突變基因類型最低檢測限驗證。

1.1.3病理組織切片的提取方法應與說明書一致，如申報產(chǎn)品適用于多種病理組織切片制作方法，最低檢測限應對每種病理組織切片制作方法進行驗證。

1.2分析特異性

1.2.1交叉反應

該類產(chǎn)品主要與肺部腫瘤存在較強關聯(lián)性，申請人在設計交叉反應研究時應將此點納入考慮。

1.2.1.1申請人應考慮與靶序列的核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的野生型或其他突變類型序列的交叉反應。建議交叉反應驗證考慮以下因素：EGFR基因不同序列；HER家族不同基因；不同濃度的野生型人DNA樣本、非人類基因組基因、肺部相關感染微生物等。

1.2.1.2對于可能產(chǎn)生交叉反應的病原體，需在有臨床意義相關濃度下進行檢測，細菌濃度水平建議至少106 cfu/mL，病毒濃度水平建議至少105 pfu/mL。需明確進行交叉反應的病原體類型及滴度。人野生型DNA至少包含100ng/μL野生型核酸樣本，應提供所有用于交叉反應驗證的突變或野生型序列來源、序列確認和濃度選擇等試驗資料。

1.2.2干擾物質

1.2.2.1申請人應根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型確定潛在的干擾物質，如：常見治療藥物，病理組織處理過程及樣本穿刺過程的緩沖液、處理液等。

1.2.2.2用于干擾試驗的樣本，建議選擇醫(yī)學相關水平的干擾物質濃度，至少對EGFR突變基因弱陽性樣本進行驗證。

1.2.3有關分析特異性的信息應在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標】項中有所體現(xiàn)。

1.3精密度

申請人應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求。具體實驗方法可以參考國際或國內有關體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求：

1.3.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關的驗證。

1.3.2合理的精密度評價周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

1.3.3用于精密度評價的樣本應考慮部分EGFR常見突變基因類型的臨床樣本、陽性精密度參考品、陰性精密度參考品等。

1.4陽性/陰性參考品符合率

各水平、各突變位點的陽性參考品均應按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應對各水平陽性參考品設置相應Ct值的限制；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下均應檢出為陰性；如有野生型參考品的設置，在其相應的引物探針組合下檢測應為陽性。

1.5樣本的穩(wěn)定性

1.5.1樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性

對于經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋組織切片樣本，申請人應對組織樣本保存溫度，保存年限進行限定。建議明確組織切片樣本的規(guī)范采集標準，驗證不同時間段保存的組織樣本對檢測結果的影響。

對于新鮮冰凍切片樣本，應限定新鮮冰凍切片樣本檢測時限，明確新鮮冰凍切片的切片要求。

1.5.2樣本核酸提取評價要求

申請人需設置評價方案（如：對同一NSCLC FFPE組織樣本中段部分平行切去10份切片樣本等）和評價指標，評價樣本核酸提取過程的重復性。

樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴增過程成敗的要素之一。石蠟包埋組織樣本在福爾馬林固定過程中，會使樣品中的核酸與核酸之間、核酸與蛋白之間發(fā)生交聯(lián)。由于不同組織的蛋白種類和含量存在差異，不同組織核酸提取試劑的效率可能也有所不同。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，申請人都應對核酸分離/純化環(huán)節(jié)做充分的驗證。除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見的核酸分離純化方法均有其優(yōu)勢和不足，申請人應結合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料。

1.5.3樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性

應檢測核酸的含量，設置反應體系需要的核酸含量上限和下限。如反應體系中起始DNA濃度過高，可能導致反應體系發(fā)生非特異性擴增，產(chǎn)生假陽性結果。如反應體系中起始DNA濃度過低，可能導致反應體系無靶序列擴增反應，產(chǎn)生假陰性結果。采用紫外-可見分光光度計對DNA濃度進行定量，通過260 nm/280 nm處的吸光度比值（OD260/OD280）或其他方法評價其純度。設置反應體系所需初始DNA含量范圍，如單位體積DNA濃度超過所需濃度上限或下限，應提供相應的改進措施。同時，應對核酸提取物的保存時間，保存溫度進行驗證。并評價凍融次數(shù)、儲存條件等對樣本提取后核酸序列穩(wěn)定性的影響。

1.5.4樣本完整性

在樣本提取前、提取過程、提取后以及在儲存期間，核酸會發(fā)生不同程度地降解。為使降解降低到最低程度（提取前或提取后），應避免樣品的多次冷凍/融化。必要時，申請人應評價提取前、提取后的凍融次數(shù)、儲存條件等因素。在長時間儲存后，應在使用前評價核酸的完整性。比較檢測結果與儲存前檢測結果的一致性，如采用瓊脂糖凝膠電泳或者內參基因PCR檢測等方法。

2.外周血類型評價要求

2.1最低檢測限

EGFR在外周血中含量較低且片段較短，易于降解。在評價該部分最低檢測限時，建議將擬定量的DNA儲備液、細胞系或EGFR突變擴增產(chǎn)物放入確定體積的血漿中，然后逐步稀釋，每個稀釋濃度重復檢測3次，待確定外周血中最低檢測限后，在外周血最低檢測限水平附近再額外檢測部分接近最低檢測限的樣本，確認最低檢測限DNA濃度。申請人可設置一個基礎濃度范圍，如從50pg/L濃度進行稀釋，至少包括目標檢測限和檢測限上下至少各2個梯度比例范圍的研究資料，應對本試劑可檢測的所有基因型別按照上述方法驗證最低檢測限。申請人同時需說明總DNA濃度的確定方法。

2.1.1如申報產(chǎn)品適用不同的核酸提取方法，每種核酸提取方法應配套檢測試劑進行各突變基因類型最低檢測限驗證。

2.1.2如申報產(chǎn)品適用不同適用機型，每種適用機型應配套檢測試劑進行各突變基因類型最低檢測限驗證。

2.1.3如申報產(chǎn)品適用不同外周血采血管、采集方法或保存方法，每種外周血采集方法或保存方法應配套檢測試劑進行各突變基因類型最低檢測限驗證。

2.2分析特異性

2.2.1交叉反應

該類產(chǎn)品主要與肺部腫瘤存在較強關聯(lián)性，申請人在設計交叉反應研究時應將此點納入考慮。

2.2.1.1申請人應考慮與靶序列的核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的野生型或其他突變類型序列的交叉反應。建議交叉反應驗證考慮以下因素：EGFR基因不同序列；HER家族不同基因等；不同濃度的野生型人DNA樣本、非人類基因組基因等。

2.2.1.2對于可能產(chǎn)生交叉反應的病原體，需在有臨床意義相關濃度下進行檢測，細菌濃度水平建議至少106 cfu/mL，病毒濃度水平建議至少105 pfu/mL。需明確進行交叉反應的病原體類型及滴度。人野生型DNA至少包含100ng/μL野生型核酸樣本，應提供所有用于交叉反應驗證的突變或野生型序列來源、序列確認和濃度選擇等試驗資料。

2.2.2干擾物質

2.2.2.1申請人應根據(jù)試劑盒所采用的樣本類型，確定潛在的干擾物質，如：外周血中干擾成分、人類DNA、樣本采集管及保存管中活性成分、常見治療藥物等。

2.2.2.2用于干擾試驗的樣本，建議選擇醫(yī)學相關水平的干擾物質濃度，至少對EGFR突變基因弱陽性樣本進行驗證。

2.2.3有關分析特異性的信息應在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標】項中有所體現(xiàn)。

2.3精密度

申請人應對每項精密度指標的評價標準做出合理要求。具體實驗方法可以參考國際或國內有關體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求：

2.3.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關的驗證。

2.3.2合理的精密度評價周期，對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應選擇不同的實驗室進行重復實驗以對室間精密度進行評價。

2.3.3用于精密度評價的樣本應考慮血漿基質的部分EGFR常見突變基因類型的樣本、陽性精密度參考品、陰性精密度參考品等。

2.4陽性/陰性參考品符合率

各水平、各突變位點的陽性參考品均應按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應對各水平陽性參考品設置相應Ct值的限制；陰性參考品在各個引物探針組合的檢測條件下均應檢出為陰性；在其相應的引物探針組合下檢測應為陽性。

2.5樣本的穩(wěn)定性

2.5.1樣本提取前核酸序列的穩(wěn)定性

外周血采集后，應對外周血存放條件、存放時限及溫度設置等進行驗證，包括采用抗核酸降解或防細胞裂解采血管的要求。采樣所用的防腐劑、抗凝劑、保護劑及相關試劑材料不應對核酸擴增及檢測過程造成干擾。申請人還需對抗凝劑、防腐劑、保護劑等成分進行驗證。

對于外周血樣本，因晚期肺癌患者外周血樣本中EGFR含量相對較少，基因片段較短，半衰期短。建議明確最少的外周血提取總量，必要時可以增加外周血提取總量，從而增大外周血中EGFR基因片段被提取的機率。同時，在核酸提取過程中應盡量減少核酸損耗和降解。申請人應對外周血樣本保存時間及溫度，離心參數(shù)設置等進行驗證。

外周血樣本除滿足上述要求外，還應注意全血中血漿和血清中均能分離出循環(huán)游離DNA（cfDNA，cell free DNA），但通過和同源性的血清樣本比較，血漿中cfDNA有更高的檢出率。血漿cfDNA通常片段較短，且在血液中濃度非常低。抽血后延遲血漿分離會導致血細胞裂解，釋放出基因組DNA（gDNA）至血漿中，大量增加的gDNA會稀釋腫瘤來源的cfDNA，使得突變難以檢出。因此在標本的采集、運輸及儲存過程中，防止游離DNA的降解是首要考慮的因素。其次，也應防止血液中白細胞的裂解，避免因野生型DNA的增加導致cfDNA中的EGFR突變基因無法檢測。

因cfDNA含量低，為提高EGFR突變基因檢出率，在臨床允許的情況下推薦增加血漿用量，為采集到最佳血漿標本用于后續(xù)提取游離DNA進行EGFR突變基因檢測，推薦在采血管中加入保護劑，如：游離DNA保護劑及防細胞裂解保護劑等。全血采集后建議盡快離心，分離出不含細胞成分的血漿。

2.5.2核酸提取評價要求

樣本核酸的分離/純化主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物。樣本核酸分離/純化是決定后續(xù)核酸擴增過程成敗的要素之一。一般而言，相對于單一靶序列的檢測，多基因序列檢測對樣本核酸的濃度和質量更為敏感，核酸提取步驟對于成功獲得結果至關重要。應確保具有滿足檢測反應體系數(shù)量和質量的核酸用于檢測。不同提取方法產(chǎn)出的核酸的濃度和質量不同（如：分子量、純度、單鏈/雙鏈、pH值變化）。如有多種不同的提取方法和樣品基質被推薦用于檢測，應確保同一反應體系中不同基因片段和對照品的提取效率相近。因此，無論申報產(chǎn)品是否含有核酸分離/純化的組分，申請人都應對核酸分離/純化環(huán)節(jié)做充分的驗證。除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。常見的核酸分離純化均有其優(yōu)勢和不足，申請人應結合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇核酸分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料。

2.5.3樣本提取后核酸序列的穩(wěn)定性

應檢測核酸的含量，設置反應體系所需初始DNA含量范圍，如單位體積DNA濃度低于所需濃度，應提供相應的改進措施。通過熒光染料法或其他方法評價其純度。同時，應對核酸提取物的保存時間和保存溫度進行驗證。

2.5.4樣本完整性

在樣本提取前、提取過程、提取后以及在儲存期間，核酸會發(fā)生不同程度地降解。為使降解降低到最低程度（提取前或提取后），應避免樣品的多次冷凍/融化。必要時，申請人應評價提取前、提取后凍融次數(shù)、儲存條件等因素。在長時間儲存后，應在使用前評價核酸的完整性。比較檢測結果與儲存前檢測結果的一致性，如采用瓊脂糖凝膠電泳或者內參基因PCR檢測等方法。

（五）陽性判斷值確定資料

在設定申報試劑檢測結果cut-off值確定依據(jù)時，應包括cut-off值研究方案、設定評價標準、研究過程以及研究原始數(shù)據(jù)等。方案應考慮不同影響檢測結果的因素，如人群流行病學信息、疾病類型等。應列舉cut-off值計算過程中采用的所有統(tǒng)計學方法。如果試劑存在灰區(qū)，應解釋說明如何確定灰區(qū)范圍。明確臨界值在不同的樣本類型是否有差異。應在獨立樣本人群中對研究擬確定的cut-off值進行充分驗證。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及申報試劑的穩(wěn)定性。主要包括效期穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性（如適用）、運輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結論。對于效期穩(wěn)定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

（七）臨床評價資料

申請人應在符合要求的臨床機構，在滿足臨床試驗最低樣本量要求的前提下，根據(jù)產(chǎn)品臨床預期用途、相關疾病的流行率和統(tǒng)計學要求，制定能夠證明其臨床性能的臨床試驗方案，同時最大限度地控制試驗誤差，提高試驗質量并對試驗結果進行科學合理的分析。

1.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統(tǒng)計學、臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構的實驗室內并由本實驗室的技術人員操作完成，申報機構的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

方案中臨床樣本信息應明確以下信息：采集時間要求、標本類型要求、采樣質量的要求，該類要求應與產(chǎn)品說明書中規(guī)定的要求一致，如產(chǎn)品說明書中未列明，應在臨床方案中進行列明。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例在被排除出臨床研究時都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結果時應采用盲法以保證試驗結果的客觀性。各研究機構選用的參比試劑應完全一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。臨床方案中還應明確復核試劑及方法。另外，考核試劑適用的樣本類型、可檢測的突變基因類型不應超越參比試劑的相應檢測范圍，若此種情況發(fā)生，則應選擇其他合理參比方法對額外的樣本類型和突變基因類型進行驗證。

2.臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則，必須獲得臨床試驗機構倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得或試驗結果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見及受試者的知情同意書。對于例外情況，如客觀上不可能獲得受試者的知情同意或該臨床試驗對受試者幾乎沒有風險，可經(jīng)倫理委員會審查和批準后免于受試者的知情同意。

3.臨床研究機構的選擇

建議申請人在選擇臨床機構時，應在國內不同區(qū)域選擇臨床機構，盡量使各機構的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性；臨床研究機構進行EGFR突變基因檢測應建立PCR標準實驗室，并建立實驗室質量管理體系以確保檢測結果的準確性。PCR實驗室技術人員應接受過PCR上崗培訓，且技能熟練。操作人員必須是接受過良好培訓的技術人員，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比方法都應處于有效的質量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復性。

4.考核試劑適用樣本類型設置要求

科學研究表明，NSCLC病理組織樣本與外周血樣本EGFR突變基因陽性檢出率存在差異，且在EGFR-TKIs藥物臨床研究中兩類樣本類型的EGFR-TKIs藥效學評價方式也存在差異。因此，本部分對病理組織樣本類型臨床研究要求與外周血樣本類型臨床研究要求分別進行說明，其中病理組織樣本總臨床樣本例數(shù)不少于1000例，包含4.1項中一致性評價臨床例數(shù)要求與5項中EGFR突變基因個體化治療相關臨床例數(shù)要求。外周血樣本總臨床樣本例數(shù)不少于1000例，包含4.2項中一致性評價臨床例數(shù)要求與5項中EGFR突變基因個體化治療相關臨床例數(shù)要求。

4.1 NSCLC病理組織樣本類型具體要求

4.1.1對比方法選擇

4.1.1.1如申報試劑已有同類上市產(chǎn)品，其臨床研究可以選擇已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，同時應充分了解產(chǎn)品方法學、臨床預期用途、主要性能指標、陽性判斷值、突變基因位點選擇等，以便對試驗結果進行科學分析。采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，至少證明本品與已上市產(chǎn)品等效。對比已上市同類試劑應具有相同的突變位點且對比試劑檢測結果應可以區(qū)分每個突變型別，以確?？己嗽噭┡c對比試劑具有明確可比性。

4.1.1.2如選擇核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的對比方法，驗證考核試劑檢測結果與核酸序列測定（測序）結果之間的一致性情況，臨床研究報告中應對選用的測序方法作詳細介紹。

申請人應提供以下關于測序部分的詳細試驗資料，并經(jīng)臨床試驗機構簽章確認。

4.1.1.2.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

4.1.1.2.2測序方法所用引物相關信息，如基因區(qū)段選擇、分子量、純度、功能性實驗等資料。引物設計應能區(qū)分所有基因型但需避開考核試劑擴增的靶核酸區(qū)段。

4.1.1.2.3應對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報試劑的相關性能進行適當比對分析。

4.1.1.2.4測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

4.1.1.2.5應選擇有代表性的樣本測序圖譜及結果分析資料。

4.1.2病例選擇

臨床試驗應以非小細胞肺癌腫瘤患者為主要研究對象，其中應涵蓋考核試劑所聲稱的所有基因型且每種突變型別應有一定量的陽性病例。對于陰性病例的選擇，也應考慮到交叉反應驗證的需要，從臨床角度考察其分析特異性。若產(chǎn)品適用于多種樣本類型，則應對所有樣本類型均進行臨床驗證。具體要求如下：

4.1.2.1臨床樣本類型以肺腺癌為主，還應包括一定數(shù)量的其他類型肺癌及肺部腫瘤初治/復發(fā)人群等。

4.1.2.2如申報試劑樣本類型適用于冰凍新鮮樣本，應完成不少于200例冰凍新鮮樣本。

4.2外周血樣本類型具體要求

4.2.1對比方法學選擇

4.2.1.1如申報試劑已有同類上市產(chǎn)品，其臨床研究可以選擇已批準上市、臨床普遍認為質量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，同時應充分了解產(chǎn)品方法學、臨床預期用途、主要性能指標、陽性判斷值、突變基因位點選擇等，以便對試驗結果進行科學分析。采用考核試劑與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。對比已上市同類試劑應具有相同的突變位點且對比試劑檢測結果應可以區(qū)分不同突變型別，以確?？己嗽噭┡c對比試劑具有明確可比性。

4.2.1.2如選擇核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗研究的對比方法，驗證考核試劑檢測結果與核酸序列測定（測序）結果之間的一致性情況，臨床研究報告中應對選用的測序方法作詳細介紹。

4.2.1.3因外周血中EGFR突變基因片段較短、含量較低，在外周血檢測EGFR突變基因片段中可選擇高通量核酸序列測定方法或其他靈敏度較高的檢測方法作為此類試劑臨床試驗研究的對比方法，驗證考核試劑檢測結果與核酸序列測定（測序）結果之間的一致性情況，臨床研究報告中應對選用的測序方法作詳細介紹。

申請人應提供以下關于測序部分的詳細試驗資料，并經(jīng)臨床試驗機構簽章確認。

4.2.1.3.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

4.2.1.3.2測序文庫構建組分的主要組成、原理介紹。

4.2.1.3.3數(shù)據(jù)庫（參考序列）類型、數(shù)據(jù)庫的溯源信息、完整性等信息。

4.2.1.3.4生物信息學分析軟件、數(shù)據(jù)存儲中心、異常情況處置方案等信息。

4.2.1.3.5測序方法所用引物、探針、接頭、連接酶、聚合酶、逆轉錄酶及限制性內切酶相關信息，如序列選擇，分子量、純度、保存穩(wěn)定性、功能性實驗及所有酶的酶活性等資料。引物設計應能區(qū)分所有基因型但需避開考核試劑擴增的靶核酸區(qū)段。

4.2.1.3.6應對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與申報試劑的相關性能進行適當比對分析。

4.2.1.3.7測序方法應建立合理的陽性質控品和陰性質控品對臨床樣本的檢測結果進行質量控制。

4.2.1.3.8應選擇有代表性的樣本測序數(shù)據(jù)和注釋文件資料。

4.2.2病例選擇

臨床試驗應以非小細胞肺癌腫瘤患者為主要研究對象，其中應涵蓋考核試劑所聲稱的所有基因型且每種突變型別均應有一定量的陽性病例。對于陰性病例的選擇，也應考慮到交叉反應驗證的需要，從臨床角度考察其分析特異性。具體要求如下：

4.2.2.1臨床樣本類型以肺腺癌為主，還應包括一定數(shù)量的其他類型肺癌及肺部腫瘤初治/復發(fā)人群等。

4.2.2.2臨床樣本類型比對方式

應包括至少200例腫瘤患者同源性外周血樣本和組織學樣本對比臨床研究資料。

4.2.2.3如考核試劑檢測系統(tǒng)適用不同類型外周血保存方法，建議每種外周血保存方法應配合申報檢測系統(tǒng)，完成不少于200例同源性臨床對比研究。

5.EGFR突變基因個體化治療相關臨床研究要求

依據(jù)EGFR-TKI靶向治療臨床需求，申請人除在完成與同類產(chǎn)品一致性臨床研究外，還需提供EGFR突變基因檢測試劑盒與相關腫瘤藥物關聯(lián)臨床研究資料，表明考核試劑與特定腫瘤藥物伴隨使用可以使患者臨床獲益的客觀證據(jù)。主要考慮以下幾種情況：

5.1考核試劑應滿足臨床需求，申請人可采用基于特定藥物研究觀察終點的前瞻性隊列或回顧性隊列臨床研究，或其他臨床研究方法。采用其他臨床研究方法時，臨床研究方案應考慮包括該產(chǎn)品預期目標人群，如經(jīng)過特定腫瘤藥物治療的患者人群。同時，為保證其他臨床研究效能，應考慮選用已聯(lián)合特定腫瘤藥物臨床研究的體外診斷試劑作為全部或部分考核試劑檢測結果的對比方法。

隨著腫瘤個體化藥物研究持續(xù)深入，基于腫瘤患者直接臨床獲益證據(jù)，EGFR部分突變基因位點（如耐藥突變基因位點）可能被賦予新的臨床意義。申請人可采用基于新上市藥物研究觀察終點的前瞻性隊列或回顧性隊列臨床研究，或其他臨床研究方法。采用其他臨床研究方法時，臨床研究方案應考慮包括該產(chǎn)品預期目標人群，如經(jīng)過新上市腫瘤藥物治療的患者人群。同時，為保證其他臨床研究效能，應考慮選用已聯(lián)合新上市腫瘤藥物臨床研究的體外診斷試劑作為全部或部分考核試劑檢測結果的對比方法。

5.2考核試劑部分突變基因類型在中國境內若屬于首次申報，因EGFR突變基因在不同種族中人群易感性不同，申請人應考慮EGFR突變基因可能在不同人群中的差異。在注冊申報時，應提供突變類別在中國人群中的突變比例等臨床評價資料。

5.3 EGFR突變基因個體化治療相關臨床研究的臨床樣本量受研究疾病、研究目的和研究終點的影響。樣本量大小的估計應根據(jù)治療作用大小的預期、變異程度的預估、統(tǒng)計分析方法等來確定。5.EGFR突變基因個體化治療相關臨床研究要求中樣本量統(tǒng)計方法如與（七）臨床評價資料其他部分臨床樣本量統(tǒng)計方法存在區(qū)別，申請人需合理選擇該項樣本量的計算方法。

因與EGFR突變基因檢測試劑盒聯(lián)合使用的不同藥物臨床研究療效存在差異，該部分EGFR突變基因檢測試劑臨床評價指標設置需主要依據(jù)藥物臨床部分評價指標進行聯(lián)合設置。應明確抗腫瘤藥物臨床試驗終點。如：總生存期（Overall Survival，OS）、基于腫瘤測量的終點如無病生存期（DFS）、客觀緩解率（ORR）、疾病進展時間（TTP）、無進展生存期（PFS）和治療失敗時間（TTF）等，或基于癥狀評價的終點等。在該部分研究中，申請人應提交患者相關臨床診療信息如治療前/后的腫瘤生物學標志物、CT或PET-CT等影像檢查結果，并匯總分析相關藥物治療非小細胞肺癌患者前后的臨床效果。

5.4考核試劑適用樣本類型如包括組織學樣本或/和外周血樣本。組織學樣本與外周血樣本需分別進行相關臨床研究，依據(jù)考核試劑不同樣本類型預期用途，該部分臨床試驗要求原則可參照5.1項要求執(zhí)行。

6.統(tǒng)計學分析

在采用對比實驗進行一致性研究時，臨床試驗結果的統(tǒng)計應選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結果一致性分析、陰性/陽性符合率、陽性預測值、陰性預測值、kappa檢驗等，統(tǒng)計分析應可以證明不同方法的檢測結果有無明顯統(tǒng)計學差異。在臨床研究方案中應明確統(tǒng)計檢驗假設，設置a值及P值假設條件，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。

建議采用四格表對考核試劑和對比方法學統(tǒng)計分析。統(tǒng)計每個突變類別陽性符合率和在所有陽性病例中所占比例。對本次臨床研究中人群基本特征進行分析，例如：年齡，性別，疾病類型等建議進行統(tǒng)計分析，如表1

7.臨床試驗總結報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結果分析、結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結報告中對以下內容進行詳述。

7.1臨床試驗總體設計及方案描述

7.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究機構選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

7.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數(shù)及標準。

7.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

7.1.4統(tǒng)計學方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結果的標準。

7.2具體的臨床試驗情況

7.2.1臨床研究所用產(chǎn)品的名稱、批號、有效期及所用機型等信息，以及對比試驗產(chǎn)品的注冊情況。

7.2.2對各研究機構的病例數(shù)、年齡分布情況進行綜合分析，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

7.2.3質量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、質控品運行情況，對檢測精密度、質控品測量值的抽查結果評估。

7.2.4具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本保存、結果不一致樣本的校驗等。

7.3統(tǒng)計學分析

7.3.1數(shù)據(jù)預處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程是否涉及對方案的修改等。

7.3.2不同方法學之間不同突變基因型別的陽性符合率、陰性符合率、總體符合率。

7.3.3統(tǒng)計分析應可以證明不同方法的檢測結果有無明顯統(tǒng)計學差異。在臨床研究方案中應明確統(tǒng)計檢驗假設，設置a值及P值假設條件，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。   

對不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢測結果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同年齡段人群分別進行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

7.4討論和結論

對總體結果進行總結性描述并簡要分析試驗結果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結論。

（八）產(chǎn)品技術要求

應符合《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）要求，明確產(chǎn)品各項性能評價要求以及試驗方法，將申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內容作為附錄附于產(chǎn)品技術要求正文后。附錄中應將待測靶基因的基因位點，引物/探針設計及來源，參考品設置、來源及驗證情況，各種酶的來源、特性及驗證等重點內容予以明確。

1.病理組織樣本類型EGFR突變基因檢測試劑的產(chǎn)品技術要求應主要包括以下性能指標：物理性狀、試劑盒內陰/陽性對照品（質控品）的Ct值要求（包括內標）、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。

2.外周血樣本類型EGFR突變基因檢測試劑的產(chǎn)品技術要求應主要包括以下性能指標：試劑盒內陰/陽性對照品（質控品）的Ct值要求（包括內標）、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。

如果申報試劑有相應的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的產(chǎn)品技術要求不得低于國家/行業(yè)標準的要求。

（九）產(chǎn)品注冊檢驗報告

根據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）的要求，首次申請注冊的第三類體外診斷試劑產(chǎn)品應在具有相應醫(yī)療器械檢驗資質和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構進行連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢驗。對于已經(jīng)有國家標準品的檢驗項目，在注冊檢驗時應采用相應的國家標準品進行，對于目前尚無國家標準品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應建立自己的參考品體系并提供相應的內部參考品。

（十）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預期用途、標本采集及處理、檢驗方法、檢驗結果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據(jù)。產(chǎn)品說明書的撰寫應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產(chǎn)品說明書中相關技術內容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結果保持一致。如產(chǎn)品說明書中部分內容引用自參考文獻，則應以規(guī)范格式對此內容進行標注，并列明所有引用文獻信息。

結合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對EGFR突變基因檢測試劑說明書的重點內容進行詳細說明，以指導注冊申請人更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測人非小細胞肺癌（NSCLC）中腫瘤病理組織或外周血或其他體液樣本的EGFR突變基因。

1.2建議列表表述EGFR多個突變基因型別，列明不同外顯子中突變基因的排列順序。至少明確產(chǎn)品外顯子、突變位點、cosmic ID、突變位點臨床意義及EGFR基因信息所使用的數(shù)據(jù)庫。

1.3 EGFR突變基因檢測的目標人群：推薦病理診斷為轉移性或進展期肺腺癌、含有腺癌成分、具有腺癌分化或不能分型的NSCLC患者；不吸煙或活檢標本較小或混合組織學形態(tài)的鱗癌患者；有必要進行分子檢測的鱗癌患者。因肺癌個體化診療發(fā)展和研究不斷深入，該目標人群可能隨著個體化藥物和試劑發(fā)展研究而發(fā)生微調，建議申請人參照最新肺癌研究指南或專家共識。

1.4申報試劑應伴隨特定腫瘤治療藥物聯(lián)合進行臨床試驗研究，并證明兩者伴隨使用具有顯著的臨床治療意義，說明書中需明確具體藥物通用名稱，并簡要介紹相關的臨床患者受益情況。

1.5因研究顯示，大部分（并非全部）晚期NSCLC患者的血液中存在cfDNA。但血液游離DNA片段通常較短，在晚期癌癥患者血液中濃度極低。外周血樣本人群，需限定為晚期NSCLC患者，且作為不易獲取NSCLC組織樣本時的補充手段。如可以獲得病理組織時，建議以病理組織提取結果優(yōu)先考慮。如外周血檢測EGFR檢測結果懷疑為假陰性時，建議盡量采集該患者腫瘤組織樣本進行檢測。

1.6應介紹相關的臨床背景，包括相關適用人群特征、腫瘤的組織類型、適用的樣本類型、待測靶基因序列的特征及選擇依據(jù)、靶基因及其表達蛋白在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到的作用、相關藥物或其他治療技術及其作用機理、與待測突變位點可能存在的關系等。

1.7明確說明該試劑盒僅用于對特定腫瘤患者靶基因序列的檢測，其檢測結果僅供臨床參考，不應作為患者個體化治療的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應結合患者病情、藥物適應癥、治療反應及其他實驗室檢測指標等因素對檢測結果進行綜合判斷。

2.【檢驗原理】

2.1對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有突變位點或突變類型進行詳細描述（靶序列長度、基因座位、突變類型及相關特征等），對引物及探針設計、不同樣品反應管組合、對照品設置及熒光信號檢測原理等進行逐項介紹。

2.2詳細介紹核酸分離/純化方法、原理等。

2.3對試劑盒技術原理進行詳細介紹，建議結合適當圖示進行說明。如添加了相關的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成分】

3.1詳細說明試劑盒內各組分的名稱、數(shù)量、內容物、比例或濃度等信息，陰性/陽性對照品（或質控品）可能含有生物源性物質的組分，應說明其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

3.2明確試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，如注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的采血管和核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及該產(chǎn)品的醫(yī)療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細信息。如包含新鮮冰凍樣本，應明確穿刺工具、標本處理試劑等信息。

4.【儲存條件及有效期】

介紹試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、機載穩(wěn)定性（如適用）、凍融次數(shù)要求等。

5.【適用儀器】

列明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【樣本要求】 

EGFR突變基因檢測樣本一般采用腫瘤部位手術切除樣本、活檢組織及細胞學樣本。臨床取材方法主要包括手術、纖維支氣管鏡下活檢、經(jīng)皮肺穿刺活檢、胸水/胸腔鏡/淋巴結穿刺活檢、支氣管內超聲引導細針穿刺活檢等。無法獲取足夠腫瘤組織及細胞學樣本的晚期肺腺癌患者，可用血液樣本進行EGFR突變基因檢測。原發(fā)灶或轉移灶均適合檢測。

6.1對組織學樣本類型作詳細介紹，明確組織樣本采集標準依據(jù)。用于腫瘤組織突變基因檢測的標本，在進行分子檢測前，須對腫瘤細胞進行評估。如果為轉移的腫瘤組織標本，其形態(tài)學必須與原發(fā)灶的形態(tài)學一致。腫瘤細胞所占比例需達到所用擴增檢測方法的要求。       

6.2對外周血樣本作詳細介紹，包括樣本來源、采血要求、采集量、保存方式、樣本處理方式、采集管要求、防腐劑、抗凝劑、保護劑及相關試劑材料等。

6.3如申報產(chǎn)品適用樣本類型中包括其他體液樣本或新鮮組織樣本等應詳細描述不同樣本類型樣本采集器具、采集方式、樣本處理要求、注意事項等。

6.4明確樣本處理及保存條件：核酸分離/純化前樣本的預處理、保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。

6.5在核酸分離/純化過程結束后，應采用適當方法對分離/純化后的核酸儲備液進行質量控制。比如，采用分光光度計法、熒光染料法或其他方法對分離/純化后的核酸儲備液進行濃度、純度檢測，并依據(jù)性能驗證結果給出用于擴增試驗的核酸溶液濃度范圍要求。如分離/純化后的核酸儲備液質量（如濃度范圍）不符合要求，應重新取材或擴大樣本量再進行核酸分離/純化。

6.6明確操作過程中各種制備液的穩(wěn)定性要求，如各類混合液（Mix）、DNA儲備液、反應終體系等（常溫/冷藏/冷凍/凍融次數(shù)限制等）。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1 FFPE組織樣本脫蠟過程，應分別描述封固于載玻片與未封固于載玻片（如有）的脫蠟步驟。

7.2試劑配制方法、注意事項。

7.3核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質控品）應參與樣本核酸的平行提?。ㄈ邕m用），以對核酸分離/純化環(huán)節(jié)進行合理的質量控制。

7.4擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。

7.5 PCR各階段的溫度、時間設置、循環(huán)數(shù)設置及相關注意事項。

7.6儀器及軟件設置：特殊參數(shù)，待測基因、內標和對照品的熒光通道選擇等。

8.【陽性判斷值】

陽性判斷值的描述包括基線的確定方法和對閾值循環(huán)數(shù)（Ct）的要求。除Ct值要求外，建議結合是否出現(xiàn)典型S形曲線對結果進行判斷。

9.【檢驗結果的解釋】

結合陽性對照、陰性對照以及樣本管中靶基因和內標的檢測結果（Ct值），對所有可能出現(xiàn)的結果組合及相應的解釋進行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應對灰區(qū)結果的處理方式一并詳述。

10.【檢驗方法的局限性】

10.1本試劑盒的檢測結果僅供臨床參考，對患者個體化治療的選擇應結合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應等情況綜合考慮。

10.2陰性結果不能完全排除靶基因突變的存在，樣本中腫瘤細胞過少、核酸過度降解或擴增反應體系中靶基因濃度低于檢測限亦可造成陰性結果。

10.3腫瘤組織（細胞）可能存在較大異質性，不同部位取樣可能會得到不同的檢測結果。

10.4不合理的樣本采集、轉運及處理，以及不當?shù)脑囼灢僮骱蛯嶒灜h(huán)境均有可能導致假陰性或假陽性結果。

10.5明確該檢測僅限于規(guī)定的樣本類型及檢測系統(tǒng)（包括適用機型、核酸分離/純化試劑、檢測方法等）。

10.6罕見EGFR突變基因檢測結果陽性對臨床用藥的指導，應結合臨床個體化用藥研究成果綜合進行評價。

10.7本檢測試劑不適用EGFR拷貝數(shù)表達量的檢測。

10.8本檢測試劑的檢測范圍僅包括檢測試劑聲稱的基因突變位點范圍，不包括檢測試劑盒聲明之外的基因突變位點的檢測。

11.【產(chǎn)品性能指標】

詳述以下性能指標：

11.1病理組織樣本類型性能指標

11.1.1對相應國家參考品（如有）檢測的符合情況。

11.1.2企業(yè)內部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設置以及評價標準等信息。

11.1.3最低檢測限：說明在試劑盒規(guī)定的檢測條件及擴增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃度。重點考慮原始模板中突變基因的百分率和擴增終體系中核酸濃度兩個因素對最低檢測限的影響，并簡單介紹最低檢測限的確定方法。

11.1.4精密度：精密度參考品的組成、來源、濃度梯度要求及評價標準，不同濃度精密度參考品的檢測結果。

11.1.5分析特異性

11.1.5.1對分析性能評估中特異性研究內容進行歸納。核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的野生型或其他突變類型序列間交叉反應、EGFR野生型DNA驗證、非人類組基因驗證等信息。

11.1.5.2潛在干擾物質驗證

如果經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應出現(xiàn)陽性結果，則應該對存在交叉反應的核酸序列及濃度進行驗證并在產(chǎn)品說明書中表明這種假陽性發(fā)生的可能，做出相關的提示。

11.1.6對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結果。

11.2外周血樣本類型性能指標

11.2.1對相應國家參考品（如有）檢測的符合情況。

11.2.2最低檢測限：說明在試劑盒規(guī)定的檢測條件及擴增體系中，試劑盒能夠覆蓋的所有突變類別的最低檢出濃度，并簡單介紹最低檢測限的確定方法。

11.2.3企業(yè)內部陽性/陰性參考品符合率，陽性/陰性參考品的組成、來源、濃度梯度設置以及評價標準等信息。

11.2.4精密度：精密度參考品的組成、來源、濃度梯度要求及評價標準，不同濃度精密度參考品的檢測結果。

11.2.5分析特異性

11.2.5.1對分析性能評估中特異性存在內容進行歸納。核酸序列相近或具有同源性、易引起交叉反應的野生型或其他突變類型序列間交叉反應、EGFR野生型DNA驗證、非人類組基因驗證等信息。

11.2.5.2潛在干擾物質驗證。

如果經(jīng)驗證發(fā)現(xiàn)某些序列與靶序列的交叉反應出現(xiàn)陽性結果，則應該對存在交叉反應的核酸序列及濃度進行驗證并在產(chǎn)品說明書中表明這種假陽性發(fā)生的可能，做出相關的提示。

11.2.6對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學方法及統(tǒng)計分析結果。

12.【注意事項】

應至少包括以下內容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質，應給出具有潛在感染性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3標本的處理和檢測標本的容器、檢驗過程中使用的材料的處理要符合《醫(yī)療廢物管理條例》和《醫(yī)療衛(wèi)生機構醫(yī)療廢物管理辦法》，以及國家、地區(qū)的相關要求。

三、參考文獻

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28.Clinical and Laboratory Standards Institute.Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assay：Approved Guideline. MM17-A，Vol.28 No.9，ISBN 1-56238-661-1

四、起草單位

國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術審評中心