附件：應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則第三部分生物相容性毒理學(xué)評(píng)價(jià)（2024年第23號(hào)）.doc

應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性
評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則第三部分：生物
相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)

本指導(dǎo)原則為注冊(cè)申請(qǐng)人/監(jiān)管人員提供關(guān)于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)相關(guān)方面的信息。

本指導(dǎo)原則是對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)的一般要求，注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)具體產(chǎn)品的特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充分說(shuō)明和細(xì)化。注冊(cè)申請(qǐng)人還應(yīng)依據(jù)具體產(chǎn)品的特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

本指導(dǎo)原則是對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)人和審評(píng)人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能滿足相關(guān)法規(guī)要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進(jìn)行適時(shí)的調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于與人體直接或間接接觸，由納米材料組成或包含納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)。

不適用于：

- 應(yīng)用納米材料的體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）產(chǎn)品；

- 應(yīng)用納米材料的賦能技術(shù)（如納米機(jī)器人）；

- 應(yīng)用納米材料的藥品；

- 應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械在制造和廢棄過(guò)程中造成的職業(yè)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

二、醫(yī)療器械中與納米材料相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的層級(jí)評(píng)價(jià)方法

本指導(dǎo)原則描述的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，是指注冊(cè)申請(qǐng)人在醫(yī)療器械產(chǎn)品中應(yīng)用了納米材料，且該納米材料被設(shè)計(jì)為發(fā)揮預(yù)期功能。此類醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)價(jià)應(yīng)首先執(zhí)行GB/T 16886系列標(biāo)準(zhǔn)文件及醫(yī)療器械法律法規(guī)的內(nèi)容，再結(jié)合本指導(dǎo)原則描述的納米材料特殊考慮點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)研究。納米材料的安全風(fēng)險(xiǎn)與常規(guī)材料不同，主要取決于納米材料的化學(xué)成分、物理化學(xué)性質(zhì)、納米特性、納米結(jié)構(gòu)與形貌、與組織相互作用方式以及暴露途徑與水平等。相比于常規(guī)材料，納米材料在樣品制備時(shí)會(huì)有溶解性和分散性的區(qū)別，以及穩(wěn)定性和均一性的要求，因此可能需要考慮納米材料在樣品制備時(shí)的特殊性；由于納米顆粒被認(rèn)為可能穿越所有生物屏障，包括血腦屏障和胎盤屏障等，因此可能需要考慮納米材料的全身毒性，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和生殖/發(fā)育毒性；“納米蛋白冠”的形成，可能會(huì)影響其生物響應(yīng)、動(dòng)力學(xué)、蓄積和毒性等生理效應(yīng)；有些納米材料具有類佐劑特性，可能會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，需要關(guān)注免疫毒性；納米材料被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)清除、在特定組織器官分布、形成“納米蛋白冠”等，可能改變其毒代動(dòng)力學(xué)特征。因此，應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)內(nèi)容，在兼顧GB/T 16886系列標(biāo)準(zhǔn)文件中關(guān)于常規(guī)器械評(píng)價(jià)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)考慮與納米材料有關(guān)的其他問(wèn)題，如樣品制備，吸收、分布、代謝和排泄/清除（ADME）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和免疫毒性等。對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械進(jìn)行生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，需根據(jù)GB/T 16886.1附錄A中描述的生物學(xué)評(píng)價(jià)框架開展評(píng)價(jià)，并參考GB/Z 16886.22、本指導(dǎo)原則第三章及附件一中所描述的納米材料特殊考慮點(diǎn)設(shè)計(jì)研究/試驗(yàn)方案。

在對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)，如果納米材料吸收和分布導(dǎo)致納米材料的內(nèi)部暴露、反應(yīng)活性、代謝動(dòng)力學(xué)或生物持久性發(fā)生改變時(shí)，可能觸發(fā)進(jìn)一步的試驗(yàn)，用于研究非常規(guī)的評(píng)價(jià)終點(diǎn)（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能終點(diǎn)）。

為了生成有效的毒理學(xué)數(shù)據(jù)用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，更加高效地識(shí)別和評(píng)價(jià)特定風(fēng)險(xiǎn)，本指導(dǎo)原則提供了層級(jí)研究方法，用于逐步對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械中與納米材料相關(guān)的安全風(fēng)險(xiǎn)開展識(shí)別和評(píng)估。

層級(jí)1：注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)醫(yī)療器械已有信息（GB/T 16886.1）和理化表征結(jié)果判斷終產(chǎn)品中是否有納米材料，若判斷無(wú)納米材料，則按照常規(guī)醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究流程進(jìn)行；若判斷有納米材料，則收集納米材料的暴露可能性、表界面生物效應(yīng)等信息，必要時(shí)開展納米材料脫落和釋放研究（參見本系列指導(dǎo)原則第二部分：理化表征）、與接觸部位的表界面生物效應(yīng)研究。基于所收集信息，可參考以下路徑進(jìn)行應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)：

（1）若無(wú)納米材料暴露可能性且接觸部位無(wú)納米材料相關(guān)的表界面生物效應(yīng)，則按照常規(guī)醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究流程進(jìn)行；

（2）若缺乏評(píng)估納米材料暴露的可能性的方法，或難以排除暴露可能性，或試驗(yàn)結(jié)果證明有暴露可能性，則進(jìn)行層級(jí)2的研究。

（3）若接觸部位存在與納米材料相關(guān)的表界面生物效應(yīng)，則進(jìn)行層級(jí)2的研究。

基于當(dāng)前科學(xué)技術(shù)水平和認(rèn)知，評(píng)估應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械中納米材料暴露可能性和與接觸部位表界面生物效應(yīng)的評(píng)價(jià)方法和技術(shù)手段還不夠完善，鼓勵(lì)注冊(cè)申請(qǐng)人根據(jù)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的特性，基于個(gè)案處理原則對(duì)納米材料的脫落和釋放、與接觸部位的表界面生物效應(yīng)進(jìn)行研究，保證試驗(yàn)方法、檢測(cè)技術(shù)等因素的可靠性，并持續(xù)更新。

層級(jí)2：對(duì)于僅在接觸部位有暴露或生物效應(yīng)的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，主要考察與局部效應(yīng)相關(guān)的試驗(yàn)終點(diǎn)，必要時(shí)進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究，考察局部組織分布特征，還應(yīng)關(guān)注納米材料向引流淋巴結(jié)遷移及進(jìn)入血液引發(fā)全身效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于有潛在全身暴露或全身效應(yīng)的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，主要針對(duì)常規(guī)評(píng)價(jià)終點(diǎn)進(jìn)行研究/試驗(yàn)，同時(shí)增加特殊指標(biāo)的檢測(cè)，考察是否有潛在的特殊毒性風(fēng)險(xiǎn)，如免疫毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性等，并進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究，考察主要組織器官的分布、蓄積和清除特性，來(lái)決定是否有必要進(jìn)行深入研究。

層級(jí)2的步驟如下：參考GB/T 16886.1附錄A選擇評(píng)價(jià)終點(diǎn)，并按照應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械評(píng)價(jià)要求設(shè)計(jì)試驗(yàn)，具體參見本指導(dǎo)原則附件一。GB/T 16886.1附錄A列出了一個(gè)制定生物學(xué)評(píng)價(jià)的框架，除適用于常規(guī)醫(yī)療器械外，也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。但由于納米材料或納米結(jié)構(gòu)可能引發(fā)非預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)，若已有信息或數(shù)據(jù)證明應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械在某些生物學(xué)評(píng)價(jià)終點(diǎn)有額外的安全風(fēng)險(xiǎn)考慮點(diǎn)，可在層級(jí)2開展相關(guān)研究。因此，注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合納米材料的納米特性及暴露特征，基于個(gè)案處理的原則，提供評(píng)價(jià)終點(diǎn)選擇的理由，并闡述評(píng)價(jià)終點(diǎn)選擇的科學(xué)性和合理性。

以下內(nèi)容為納米材料生物相容性與常規(guī)材料生物相容性研究差異性的舉例，具體內(nèi)容詳見附件一：

· 細(xì)胞毒性：根據(jù)細(xì)胞攝取納米材料的能力，以及納米材料與細(xì)胞的相互作用模式考慮需增加的試驗(yàn)。采用合適的細(xì)胞來(lái)測(cè)試納米材料在靶器官、接觸部位細(xì)胞、免疫細(xì)胞的攝取及生物效應(yīng)，如肝、腎為潛在靶器官時(shí)，可選擇HepG2人源肝癌細(xì)胞、LLC-PK1豬腎近曲小管細(xì)胞等進(jìn)行試驗(yàn)。

· 致敏反應(yīng)：若納米材料具備一定的透皮性或局部反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，僅進(jìn)行GPMT試驗(yàn)不足以評(píng)價(jià)納米材料的致敏反應(yīng)，可考慮增加體外替代方法并驗(yàn)證方法的適用性，如直接肽反應(yīng)性測(cè)定法（DPRA）、人細(xì)胞系激活試驗(yàn)（H-CLAT）、KeratinoSens和SenCeeTox等方法。

· 亞慢性全身毒性：該試驗(yàn)建議增加附加毒性終點(diǎn)相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)，如生殖系統(tǒng)毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性等終點(diǎn)的相關(guān)敏感指標(biāo)的檢測(cè)。

慢性毒性、致癌性、生殖/發(fā)育毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌干擾等附加毒性終點(diǎn)一般不作為層級(jí)2的首批評(píng)價(jià)終點(diǎn)，但需在層級(jí)2的其他試驗(yàn)中增加與上述終點(diǎn)相關(guān)的敏感指標(biāo)的檢測(cè)，作為是否進(jìn)入層級(jí)3的依據(jù)，如在亞慢性全身毒性試驗(yàn)中增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能觀察組合指標(biāo)的檢測(cè)，考察應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械是否有潛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。

若層級(jí)2的研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)附加毒性終點(diǎn)相關(guān)毒性指征的改變，一般無(wú)需進(jìn)入層級(jí)3的研究，而是考察層級(jí)2的研究結(jié)果是否足以進(jìn)行生物相容性/毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，若研究結(jié)果不足以進(jìn)行生物相容性/毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，則需修正試驗(yàn)條件重復(fù)層級(jí)2相關(guān)研究?jī)?nèi)容，直至完成生物學(xué)評(píng)價(jià)，或根據(jù)研究結(jié)果停止生物學(xué)評(píng)價(jià)研究。

若層級(jí)2研究結(jié)果提示明確的附加毒性終點(diǎn)相關(guān)毒性指征，則進(jìn)入層級(jí)3的研究。這些毒性指征包括但不限于納米材料存在消除緩慢、在特定的組織器官內(nèi)有蓄積的潛力、需要更長(zhǎng)時(shí)間的代謝數(shù)據(jù)，或毒性特征提示需要關(guān)注特定組織/器官的毒性等。此外，若已有信息或數(shù)據(jù)證明應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械存在生殖系統(tǒng)毒性、免疫毒性等安全性風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，可考慮直接進(jìn)行層級(jí)3的相關(guān)研究。

層級(jí)3：是對(duì)層級(jí)2中發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械附加毒性終點(diǎn)相關(guān)毒性指征發(fā)生明顯改變時(shí)，開展與毒性指征相對(duì)應(yīng)的全面的特殊試驗(yàn)，如生殖/發(fā)育毒性試驗(yàn)、致癌性試驗(yàn)、免疫毒性試驗(yàn)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性試驗(yàn)、或內(nèi)分泌干擾試驗(yàn)等，參見本指導(dǎo)原則附件一，同時(shí)伴隨相應(yīng)試驗(yàn)開展毒代動(dòng)力學(xué)研究，考察所關(guān)注的特殊組織器官中納米材料暴露、分布和蓄積特征。注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合納米材料的納米特性及暴露特征，基于個(gè)案處理的原則，提供評(píng)價(jià)終點(diǎn)選擇的理由，并闡述評(píng)價(jià)終點(diǎn)選擇的科學(xué)性和合理性。

完成層級(jí)3的研究后，結(jié)合層級(jí)2和層級(jí)3的研究結(jié)果考察是否足以進(jìn)行生物相容性/毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。若層級(jí)2、層級(jí)3的研究結(jié)果足以進(jìn)行生物相容性/毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，不必再進(jìn)行其他試驗(yàn)；否則應(yīng)重復(fù)層級(jí)2或?qū)蛹?jí)3的相應(yīng)研究?jī)?nèi)容，直至完成生物學(xué)評(píng)價(jià)，或根據(jù)研究結(jié)果停止生物學(xué)評(píng)價(jià)研究。

圖1 醫(yī)療器械中與應(yīng)用納米材料相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的層級(jí)評(píng)價(jià)方法流程圖

a.現(xiàn)有GB/T 16886.1 附錄A，以及ISO/TR 10993.22（等同轉(zhuǎn)化為GB/Z 16886.22）所提供的框架用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)是有限的，需要結(jié)合其納米特性和暴露特征考慮增加評(píng)價(jià)終點(diǎn)。

b.如層級(jí)2研究結(jié)果提示應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械存在安全性風(fēng)險(xiǎn)，如蓄積、特定器官或系統(tǒng)毒性、則在層級(jí)3中針對(duì)層級(jí)2的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究。如層級(jí)2中發(fā)現(xiàn)生殖器官有納米材料分布，應(yīng)在層級(jí)3中開展對(duì)生殖功能影響等毒性試驗(yàn)，并進(jìn)行伴隨毒代動(dòng)力學(xué)，考察所關(guān)注的特殊組織器官、關(guān)鍵組織器官中納米材料暴露、分布和蓄積特征。

c.如果出現(xiàn)以下情況，需要考慮重復(fù)進(jìn)行層級(jí)2或?qū)蛹?jí)3相關(guān)試驗(yàn)研究，如完善試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)結(jié)果存在爭(zhēng)議、試驗(yàn)結(jié)果提示需要補(bǔ)充研究?jī)?nèi)容等。

d.完成生物學(xué)評(píng)價(jià)后，可進(jìn)行產(chǎn)品的獲益-風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)，或者停止生物學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)產(chǎn)品重新進(jìn)行研究和開發(fā)。

三、生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)

（一）引言

對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)的評(píng)價(jià)包括文獻(xiàn)綜述、生物信息學(xué)、體外和體內(nèi)試驗(yàn)等一系列研究。對(duì)于醫(yī)療器械，任何試驗(yàn)的選擇策略均基于其預(yù)期用途/適用范圍。體內(nèi)研究應(yīng)采用與醫(yī)療器械和/或納米材料人體暴露途徑相關(guān)的接觸途徑進(jìn)行。所有試驗(yàn)均應(yīng)按照現(xiàn)行/有效的最佳實(shí)驗(yàn)室/治療規(guī)范進(jìn)行，數(shù)據(jù)應(yīng)由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)且有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員進(jìn)行分析解讀。對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)應(yīng)依據(jù)以下原則：

1.進(jìn)行多層級(jí)評(píng)價(jià)研究原則

應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)測(cè)試策略由其潛在外部和內(nèi)部暴露特征決定。當(dāng)理化表征、暴露評(píng)估等確定醫(yī)療器械有納米材料暴露的可能性時(shí)或相關(guān)表界面生物效應(yīng)時(shí)，除按照GB/T 16886系列國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、GB/T 42062通用要求進(jìn)行相應(yīng)的試驗(yàn)外，還應(yīng)基于納米材料風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的要求，參考GB/T 37129、GB/Z 16886.22，按照與納米材料相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的層級(jí)評(píng)價(jià)方法流程圖進(jìn)行多層級(jí)評(píng)價(jià)研究，考慮是否增加額外毒性關(guān)注指標(biāo)，以及深入開展附加毒性試驗(yàn)。

2.遵循個(gè)案處理原則

按照GB/T 16886.1的要求，醫(yī)療器械的生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)策略均應(yīng)基于醫(yī)療器械分類、接觸性質(zhì)和暴露持續(xù)時(shí)間等進(jìn)行考慮。由于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械情況復(fù)雜，本指導(dǎo)原則不可能涵蓋所有應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)的全部?jī)?nèi)容。針對(duì)某一具體產(chǎn)品，其生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)應(yīng)遵循個(gè)案處理的原則。

3.確認(rèn)測(cè)試系統(tǒng)的適用性原則

納米材料的溶解或分散狀態(tài)、樣品制備方法、劑量設(shè)計(jì)、細(xì)胞品系、動(dòng)物種屬等測(cè)試系統(tǒng)參數(shù)都可能影響試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，故需確認(rèn)測(cè)試系統(tǒng)是否適用于評(píng)價(jià)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，如樣品制備方法不適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械時(shí)，可考慮直接使用醫(yī)療器械終產(chǎn)品或代表性樣品進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。目前可用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的專屬試驗(yàn)方法尚在開發(fā)中，可參考的試驗(yàn)方法較少，已發(fā)布并正式實(shí)施的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)主要包括內(nèi)毒素試驗(yàn)（YY/T 1295）、細(xì)胞毒性試驗(yàn)（GB/T 41212、GB/T 41915、YY/T 0993）、體外溶血試驗(yàn)（YY/T 1532）。因此，注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)確認(rèn)測(cè)試系統(tǒng)的適用性，提供適合所申報(bào)產(chǎn)品特點(diǎn)的生物學(xué)評(píng)價(jià)資料。一些體外試驗(yàn)可能對(duì)于篩選目的及作用機(jī)制的研究是有用的，但這些方法的使用必須基于個(gè)案處理原則。目前經(jīng)過(guò)確認(rèn)的體外方法參見歐洲替代方法驗(yàn)證中心（EURL ECVAM）發(fā)布的方法。

4.生物組織中納米材料的表征原則

納米材料和生物組織中的生物分子相互作用可能獲得新“生物學(xué)特征”，即在表面吸附蛋白質(zhì)等生物分子（蛋白冠、生物冠）時(shí)產(chǎn)生的新性質(zhì)，可影響機(jī)體的生理響應(yīng)及毒理學(xué)特征。因此，納米材料在試驗(yàn)條件下的實(shí)際存在形式、特性和穩(wěn)定性等信息對(duì)于任何試驗(yàn)結(jié)果的解釋都是至關(guān)重要的。應(yīng)在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)（若可行）對(duì)生物組織中的納米材料進(jìn)行表征。

5.毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)判定原則

證明納米材料在細(xì)胞和/或組織中有暴露是解釋研究結(jié)果的關(guān)鍵（特別是陰性結(jié)果），缺乏這類數(shù)據(jù)對(duì)得出最終結(jié)論可能造成很大的不確定性。因此，在技術(shù)可行的情況下，應(yīng)確定納米材料是否分布在組織或細(xì)胞的特定區(qū)域，明確在試驗(yàn)系統(tǒng)中的暴露量。

（二）應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)的核心關(guān)注點(diǎn)

1.樣品制備

溶解和分散：納米材料與溶解的化學(xué)物質(zhì)不同，通常為不溶或部分溶解的納米顆粒以混懸/分散和/或更大的團(tuán)聚和聚集狀態(tài)存在。試驗(yàn)介質(zhì)/制劑（及其成分）可能影響納米材料的特性和性能。當(dāng)采用體內(nèi)或體外方法對(duì)不溶或部分溶解納米顆粒進(jìn)行測(cè)試時(shí)，一定要重點(diǎn)考慮納米材料在介質(zhì)中的分散狀態(tài)。

樣品制備：取樣和樣品制備通常是整個(gè)分析過(guò)程中至關(guān)重要的步驟，也可能是結(jié)果不確定性的最大來(lái)源。納米材料樣品制備中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是顆粒的適當(dāng)分散。目前尚無(wú)專門應(yīng)對(duì)納米材料樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)文件，注冊(cè)申請(qǐng)人可參考GB/T 16886.12提供的樣品制備通用要求進(jìn)行樣品制備。此外，建議注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)樣品制備的分散情況和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)試并記錄。

2.濃度/劑量

納米材料濃度/劑量可能因其團(tuán)聚、聚集、沉淀、與介質(zhì)中的物質(zhì)結(jié)合，或吸附在容器上而降低。為了確保在試驗(yàn)期間使用的濃度/劑量保持穩(wěn)定，任何體內(nèi)、體外毒性試驗(yàn)應(yīng)特別關(guān)注納米材料的團(tuán)聚/聚集、解聚和重聚集行為，以及納米材料的不溶/部分溶解性質(zhì)，考察納米材料在試驗(yàn)介質(zhì)中的穩(wěn)定性和均一性，以確保所用的納米材料的濃度/劑量與預(yù)期一致。

此外，在一些試驗(yàn)中，使用過(guò)高的濃度或劑量可能會(huì)改變納米材料的物理化學(xué)特性（如形成團(tuán)聚體等次級(jí)粒子），導(dǎo)致吸收、毒性降低，甚至獲得與材料固有毒性無(wú)關(guān)的結(jié)果，如吸入研究中過(guò)度負(fù)荷劑量、遺傳毒性中過(guò)高濃度導(dǎo)致細(xì)胞毒性等。因此，申請(qǐng)人應(yīng)提供選擇高濃度或劑量的依據(jù)和理由。

3.劑量單位

常規(guī)材料通常使用重量或體積劑量單位進(jìn)行檢測(cè)、表示以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（例如mg/kg，或mg/L）。然而，對(duì)于納米材料來(lái)說(shuō)，潛在生物相互作用不直接依賴于分子的濃度或數(shù)量，而依賴于納米材料/納米物體本身。納米毒理學(xué)的劑量-反應(yīng)關(guān)系可能與納米物體數(shù)量或表面積等納米特征參數(shù)更相關(guān)。因此，使用比表面積、顆粒數(shù)量等劑量單位描述納米材料的劑量-反應(yīng)關(guān)系可能更加合適。也可使用納米材料表征中得出的其他參數(shù)來(lái)表示劑量。在合適的參數(shù)識(shí)別出來(lái)之前，重要的是描述不同的劑量度量，如質(zhì)量-體積濃度、顆粒數(shù)量濃度、比表面積等，為基于質(zhì)量的劑量換算成其他參數(shù)提供足夠的信息。

4.對(duì)試驗(yàn)系統(tǒng)的干擾

內(nèi)毒素的干擾：納米材料分散體系中存在的內(nèi)毒素可能干擾試驗(yàn)系統(tǒng)，并隨試驗(yàn)系統(tǒng)的不同導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。

對(duì)基于光學(xué)原理試驗(yàn)方法的干擾：納米材料可能與試驗(yàn)系統(tǒng)或試劑相互作用，特別是在比色試驗(yàn)中（例如用于細(xì)胞活性試驗(yàn)的磺酰羅丹明B，或MTT）。另外，一些納米材料本身對(duì)光有散射/吸收，也可能干擾比色試驗(yàn)測(cè)定。這些因素需要在使用比色方法時(shí)加以考慮。

與生物分子作用：試驗(yàn)系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)/生物介質(zhì)（如細(xì)胞因子）也可能吸附到納米材料表面，造成低響應(yīng)甚至是假陰性結(jié)果。

對(duì)于此類問(wèn)題，建議增加合適的對(duì)照品或?qū)ΜF(xiàn)有方法進(jìn)行調(diào)整。例如，納米材料已被證明可干擾基于四唑化合物的試驗(yàn)，如MTS和MTT法的吸光度檢測(cè)。可在讀數(shù)前通過(guò)離心除去納米材料，以降低由納米材料產(chǎn)生的數(shù)據(jù)變異度。

5.可能的毒性機(jī)制

解離離子的毒性：一些金屬（銀）、金屬氧化物（氧化鋅）或無(wú)機(jī)非金屬/陶瓷材料在生物介質(zhì)中會(huì)（緩慢）溶解/降解，檢測(cè)的部分（或全部）毒性效應(yīng)可能都源于溶解/降解產(chǎn)生的離子。對(duì)于這類納米材料，應(yīng)在試驗(yàn)之前和試驗(yàn)期間測(cè)定溶解/降解的部分所占比例，并增加合適的離子形式對(duì)照組。

與尺寸相關(guān)的毒性：納米材料的毒性可能源自其尺寸效應(yīng)，易于進(jìn)入生物系統(tǒng)，被炎性細(xì)胞吞噬，特別是巨噬細(xì)胞和多核嗜中性粒細(xì)胞。納米材料可吸附蛋白質(zhì)和多肽形成新的蛋白質(zhì)復(fù)合物，或改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)蛋白質(zhì)降解，觸發(fā)炎性細(xì)胞的應(yīng)答過(guò)程。因此，應(yīng)關(guān)注尺寸效應(yīng)與毒性的相關(guān)性，以進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

納米材料形貌對(duì)吞噬作用的影響：納米材料的軟硬度、剛性、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞攝取、細(xì)胞內(nèi)定位、細(xì)胞內(nèi)吞機(jī)制均具有影響。例如，球狀納米顆粒被細(xì)胞內(nèi)吞的過(guò)程比棒狀或纖維狀納米材料容易和迅速。對(duì)于這類納米材料，應(yīng)關(guān)注不同納米形貌結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞攝取與毒性的影響。

（三）生物相容性/毒理學(xué)試驗(yàn)

本指導(dǎo)原則旨在為經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員提供在醫(yī)療器械評(píng)價(jià)方面對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械進(jìn)行生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)的通用方法，并在附件一中討論如何基于GB/T 16886系列標(biāo)準(zhǔn)文件、GB/Z 16886.22，及應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械特殊考慮點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)試驗(yàn)，包括試驗(yàn)設(shè)計(jì)、細(xì)胞/動(dòng)物模型選擇、研究終點(diǎn)選擇、結(jié)果解釋等內(nèi)容。

本指導(dǎo)原則代表了現(xiàn)有認(rèn)知水平下監(jiān)管部門對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)終點(diǎn)的考慮及應(yīng)對(duì)措施，未來(lái)隨著毒理學(xué)和納米材料轉(zhuǎn)歸方面的認(rèn)知增長(zhǎng)，更多試驗(yàn)方法的缺陷可能會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，本指導(dǎo)原則的內(nèi)容將隨著納米材料生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究的不斷推進(jìn)而完善。因此，建議注冊(cè)申請(qǐng)人關(guān)注研究最新進(jìn)展，并在開展應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)加以考慮，以保持對(duì)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)最新技術(shù)的持續(xù)更新。

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五、編寫單位

本指導(dǎo)原則由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心牽頭，國(guó)家納米科學(xué)中心、廣東粵港澳大灣區(qū)國(guó)家納米科技創(chuàng)新研究院、山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院、中國(guó)食品藥品檢定研究院參與編寫，由國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心負(fù)責(zé)解釋。

附件一 應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)研究相關(guān)內(nèi)容

（一）細(xì)胞毒性試驗(yàn)

作為生物相容性/毒理學(xué)評(píng)價(jià)的一部分，細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果可以作為納米材料潛在暴露和危害的證據(jù)，并確定其作用機(jī)制，有助于體內(nèi)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和解釋?？砂凑誈B/T 16886.5、YY/T 0993和ASTM E2526的要求，根據(jù)已有的數(shù)據(jù)和暴露信息合理開展應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性試驗(yàn)。

納米材料的細(xì)胞毒性依賴于細(xì)胞對(duì)其敏感性、特定受體的存在或攝取機(jī)制。納米材料可通過(guò)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，并在進(jìn)入細(xì)胞后與細(xì)胞內(nèi)不同成分相互作用并干擾細(xì)胞功能。此外，納米材料也可能通過(guò)離子釋放引起細(xì)胞毒性。根據(jù)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的預(yù)期接觸部位和可能接觸的細(xì)胞類型，一般可選擇非吞噬性細(xì)胞（如3T3小鼠成纖維細(xì)胞，L929小鼠成纖維細(xì)胞，HaCaT人源角質(zhì)形成細(xì)胞）和吞噬性細(xì)胞（如RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞，THP-1人源已分化巨噬細(xì)胞）進(jìn)行試驗(yàn)。為了獲得納米材料的危害和作用模式信息、以及暴露情況，鼓勵(lì)注冊(cè)申請(qǐng)人在能力可及范圍內(nèi)測(cè)試有代表性的靶組織部位細(xì)胞、接觸部位細(xì)胞、免疫細(xì)胞等類型。

可以考慮的特定終點(diǎn)包括細(xì)胞活力/細(xì)胞毒性（MTT、MTS、LDH法等）、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA合成（BrdU法）、能量代謝（測(cè)定ATP）、（促）炎癥反應(yīng)（作為免疫毒性的一部分）和組織屏障穿透性等。如適用時(shí)，可考慮直接接觸法評(píng)價(jià)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性。

（二）遺傳毒性試驗(yàn)

應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的遺傳毒性試驗(yàn)應(yīng)遵循醫(yī)療器械GB/T 16886.1、GB/T 16886.3的一般性原則，建議結(jié)合納米材料的特性，以遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)組合試驗(yàn)為基礎(chǔ)開展遺傳毒性評(píng)價(jià)，遺傳毒性評(píng)價(jià)方法選擇可參考GB/T 16886.3。

細(xì)胞對(duì)納米材料的攝取能力是影響其體外遺傳毒性評(píng)價(jià)結(jié)果的關(guān)鍵因素。細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)可能不適合檢測(cè)某些具有抑菌性或無(wú)法進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的納米材料。體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)建議使用可攝取納米材料的細(xì)胞系，試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮到納米材料在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的濃度和作用時(shí)間，并對(duì)細(xì)胞攝取納米材料的能力進(jìn)行分析。

如果至少有一項(xiàng)體外遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，可參考GB/T 16886.3附錄B中的后續(xù)評(píng)價(jià)流程圖選擇適宜的體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)其遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)根據(jù)最常見的體內(nèi)暴露途徑選擇適宜的體內(nèi)試驗(yàn)暴露方式，并需通過(guò)適當(dāng)方式確定納米材料在檢測(cè)組織中有一定暴露且不會(huì)被快速清除。

（三）急性毒性

醫(yī)療器械急性毒性試驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 16886.11、GB/T 16886.12）的一般要求也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。樣品制備時(shí)，應(yīng)說(shuō)明分散體系選擇的合理性。GB/T 16886.11以外的急性毒性試驗(yàn)信息可以在下述標(biāo)準(zhǔn)中找到：急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)固定劑量法（GB/T 21804），急性毒性分類方法（GB/T 21757），或者上下增減劑量法（GB/T 21826）。吸入途徑急性毒性分級(jí)方法在GB/T 21605和GB/T 28648中描述，體內(nèi)急性皮膚毒性試驗(yàn)在GB/T 21606及 GB/T 21604中描述。

（四）刺激性

納米材料的生物效應(yīng)可能導(dǎo)致其穿透皮膚、眼睛或黏膜以及被攝取，應(yīng)考慮適宜的模型評(píng)價(jià)納米材料的刺激性。GB/T 16886.23的一般要求也適用于納米材料。此外，當(dāng)局部組織生理狀態(tài)改變時(shí)，如分泌汗液的皮膚、機(jī)械損傷的表面、病理學(xué)病癥、光損傷等，對(duì)納米材料的屏障效應(yīng)也可能發(fā)生相應(yīng)改變，導(dǎo)致不同的刺激性。因此，選擇的試驗(yàn)方法應(yīng)能充分模擬應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的臨床具體使用條件和暴露途徑。

已有一些體外替代試驗(yàn)（如大鼠皮膚經(jīng)皮電阻抗試驗(yàn)，OECD 430；EpiSkin?, EpiDerm?, SkinEthic?, EST-1000，OECD 431）被驗(yàn)證用于評(píng)價(jià)化學(xué)品的刺激性。若注冊(cè)申請(qǐng)人采用體外替代方法進(jìn)行納米材料的醫(yī)療器械刺激性試驗(yàn)時(shí)，需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料。關(guān)于體外替代方法的相關(guān)內(nèi)容，將在本系列指導(dǎo)原則第五部分：體外替代測(cè)試方法/計(jì)算機(jī)模擬研究中給出。

（五）皮膚致敏反應(yīng)

納米材料的大比表面積，類佐劑效應(yīng)以及與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物都可能會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏。GB/T 16886.10描述了評(píng)估醫(yī)療器械及其成分誘發(fā)皮膚致敏反應(yīng)的試驗(yàn)方法，即鼠科動(dòng)物局部淋巴結(jié)測(cè)定（LLNA）、豚鼠最大劑量試驗(yàn)（GPMT），以及封閉式貼敷試驗(yàn)。由于納米材料的低皮膚穿透性，LLNA和封閉式貼敷試驗(yàn)可能檢測(cè)不出致敏潛力，陰性試驗(yàn)結(jié)果不能被解釋為納米材料無(wú)致敏性。GPMT試驗(yàn)盡管局部誘導(dǎo)期和激發(fā)均使用完整皮膚，但由于首次誘導(dǎo)為皮內(nèi)途徑，可能是目前檢測(cè)納米材料致敏性最相關(guān)的試驗(yàn)。

目前，采用GPMT試驗(yàn)評(píng)價(jià)納米材料的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常有限?；诂F(xiàn)有知識(shí)，不能依賴單一特定的試驗(yàn)方法來(lái)研究納米材料?？梢詢?yōu)先考慮GPMT法，再結(jié)合個(gè)案分析原則，確定最終的試驗(yàn)組合。建議注冊(cè)申請(qǐng)人根據(jù)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械特性，基于個(gè)案分析的原則，選擇適用的試驗(yàn)方法，并保持試驗(yàn)方法的持續(xù)更新。

（六）血液相容性

目前缺乏專用于評(píng)價(jià)與血液直接或間接接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械血液相容性的標(biāo)準(zhǔn)方法，體外條件下的溶血、血液學(xué)、凝血、血小板激活和補(bǔ)體激活試驗(yàn)均可以為納米材料血液相容性提供有效的參考。

對(duì)于表面具有納米材料/納米特征的醫(yī)療器械，可直接按照GB/T 16886.4開展血液相容性評(píng)價(jià)，推薦以器械表面積/血液體積的比例計(jì)算接觸體系。由于游離納米材料比常規(guī)材料有更高的比表面積，其血液相容性評(píng)價(jià)更具有挑戰(zhàn)性，在參考GB/T 16886.4、YY/T 1532進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，需特別關(guān)注納米材料特性對(duì)其進(jìn)入血液后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的影響，以及納米材料在介質(zhì)中的表征結(jié)果。

若體外試驗(yàn)不足以評(píng)價(jià)納米材料的血液相容性，可考慮結(jié)合體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，將納米材料注射到循環(huán)系統(tǒng)并評(píng)價(jià)其分布以及任何局部和全身不良反應(yīng)，如血管損害、血液學(xué)、血生化相關(guān)指標(biāo)的改變，并參考GB/T 16886.4進(jìn)行補(bǔ)體激活、凝血級(jí)聯(lián)激活、血小板激活等試驗(yàn)評(píng)價(jià)納米材料的血液相容性。

除了血液相容性常規(guī)項(xiàng)目外，建議考慮納米材料與吞噬細(xì)胞的潛在相互作用。目前尚無(wú)評(píng)價(jià)納米材料與吞噬細(xì)胞相互作用的標(biāo)準(zhǔn)方法。推薦增加內(nèi)皮細(xì)胞和/或單核細(xì)胞激活評(píng)估（如評(píng)價(jià)細(xì)胞黏附分子標(biāo)志物、促炎因子、促凝因子等）。

此外，新技術(shù)（如微流控）可能用于評(píng)價(jià)納米材料與內(nèi)皮細(xì)胞和/或血管的相互作用。

（七）毒代動(dòng)力學(xué)

1. 引言

GB/T 16886.16的一般性原則也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。與常規(guī)材料不同，組織器官可能快速攝取納米材料而不依賴于其在血液中的濃度。納米材料在組織中的分布、蓄積以及消除可能比在血漿中的暴露特征更能代表真實(shí)的暴露情況，尤其是在典型的攝取器官、靶器官中的分布情況，如肝、脾、肺等。另外，多次接觸可能導(dǎo)致納米材料在一些組織器官中蓄積和長(zhǎng)期保留，應(yīng)重點(diǎn)考察納米材料在組織器官中的分布、蓄積和消除特征。此外，腎可能是納米材料排泄的重要器官。為了識(shí)別納米材料的組織分布、蓄積和滯留潛力，有必要設(shè)計(jì)單次和多次接觸的毒代動(dòng)力學(xué)研究，并合理延長(zhǎng)樣本采集時(shí)間點(diǎn)。

接觸途徑可能影響納米材料的動(dòng)力學(xué)特征。如當(dāng)氣管內(nèi)接觸金納米顆粒（1.4 nm）時(shí)，腎臟暴露量比肝更高，而采用靜脈接觸后，肝成為最主要的靶器官。應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械表面分子粘附，不僅影響納米材料的脫落和釋放，還可能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPS）對(duì)納米材料的識(shí)別和攝取，以及經(jīng)淋巴系統(tǒng)遷移或轉(zhuǎn)運(yùn)，以及二次組織分布。如果從醫(yī)療器械中釋放的納米材料可能被吸收、分布、代謝和/或排泄，即需要進(jìn)行毒代動(dòng)力學(xué)研究。

2. 納米材料毒代動(dòng)力學(xué)研究方法

開展應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的毒代動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，建議基于層級(jí)評(píng)價(jià)流程（正文第三部分）逐步進(jìn)行。在層級(jí)1中，收集納米材料暴露信息，必要時(shí)開展應(yīng)用納米材料醫(yī)療器械的脫落和釋放體外和/或體內(nèi)試驗(yàn),進(jìn)行納米材料的暴露可能性評(píng)估。在層級(jí)2中，可在其他試驗(yàn)中增加衛(wèi)星組進(jìn)行伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究或單獨(dú)開展毒代動(dòng)力學(xué)研究，考察納米材料在主要組織器官中的分布、蓄積和清除特性。在層級(jí)3中，通常伴隨其它試驗(yàn)開展毒代動(dòng)力學(xué)研究，考察納米材料在特殊組織器官中的分布、蓄積和消除特性，如伴隨生殖/發(fā)育毒性試驗(yàn)開展毒代動(dòng)力學(xué)研究，對(duì)胎盤、乳汁中的納米材料進(jìn)行定性和定量分析。

定量分析方法一般可采用元素分析法對(duì)納米材料化學(xué)組成進(jìn)行定量分析，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）、原子吸收光譜-質(zhì)譜法（AAS-MS）等。現(xiàn)有的檢測(cè)方法中，含金屬元素的納米材料相比于其他納米材料更容易被檢測(cè)。但檢測(cè)出特定的元素并不能證明材料以納米形式存在，還需進(jìn)行納米材料的定性分析，可參考本系列指導(dǎo)原則第二部分：理化表征。具體研究時(shí)，建議先采用定量分析方法對(duì)樣品中的元素進(jìn)行檢測(cè)，若有特征元素存在，再采用納米材料特異性的方法進(jìn)行定性分析，考察化合物是否以納米形式存在。

放射性同位素或熒光染料標(biāo)記方法可用于標(biāo)記納米材料，跟蹤納米材料的生物轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，測(cè)定生物樣品中母體物質(zhì)和代謝物的總量。但某些標(biāo)記可能引起納米材料的表面化學(xué)變化，從納米材料中脫離，干擾毒代動(dòng)力學(xué)研究。因此，當(dāng)使用標(biāo)記技術(shù)時(shí)，需要考察標(biāo)記-納米材料組合物的完整性，以及對(duì)毒代動(dòng)力學(xué)特征和毒性的影響，評(píng)估方法的可用性和安全性，確保標(biāo)記物在接觸和進(jìn)入體內(nèi)后按預(yù)期發(fā)揮作用，且不改變納米材料的毒代動(dòng)力學(xué)行為。

3.不同接觸途徑的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械毒代動(dòng)力學(xué)關(guān)注點(diǎn)

（1）經(jīng)皮膚接觸途徑：應(yīng)關(guān)注皮膚損傷狀態(tài)，以及溶劑和載體效應(yīng)等因素，對(duì)納米材料穿透皮膚角質(zhì)層和吸收的影響。

（2）非經(jīng)皮膚接觸途徑：

a.眼暴露攝入：納米材料可能到達(dá)眼部深處組織，應(yīng)關(guān)注納米材料在眼部的釋放和代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。

b.呼吸道暴露攝入：納米材料除暴露于肺部，也可能存在全身暴露的情況，肺部清除的半衰期可能高達(dá)2個(gè)月，應(yīng)關(guān)注全身暴露可能性，及緩慢清除特征。

c.經(jīng)消化道暴露攝入：納米材料在消化道暴露的量通常較低，但小尺寸納米材料可能被攝取，應(yīng)關(guān)注納米材料粒徑對(duì)暴露的影響，可以使用胃腸道體外模型來(lái)研究納米材料在腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)。

d.皮下暴露攝入（植入物）：可以通過(guò)皮下注射作為經(jīng)皮植入分布研究的替代方法，并關(guān)注納米材料在淋巴結(jié)、肝、脾和肺等器官的顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象。

（八）熱原

由于納米材料表面極易吸附微生物及其產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS），干擾納米材料與生物系統(tǒng)之間的相互作用，增加熱原反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)可參考YY/T 1295給出的試驗(yàn)方法進(jìn)行。除細(xì)菌內(nèi)毒素介導(dǎo)的致熱性外，也需考慮納米材料介導(dǎo)的致熱性，可參考GB/T 16886.11給出的試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)試。

（九）植入

GB/T 16886.6中提供了不同組織（皮下、肌肉、骨、腦）局部植入的標(biāo)準(zhǔn)方法，也適用于降解和非降解納米材料、固體和非固體納米材料如多孔材料、液體、凝膠、膏狀和粉末等不同形態(tài)。

對(duì)于非降解納米材料，短期反應(yīng)評(píng)估一般為1周至4周，長(zhǎng)期反應(yīng)評(píng)估則一般超過(guò)12周。在肌肉和結(jié)締組織中，植入后9周至12周時(shí)細(xì)胞群呈穩(wěn)定狀態(tài)，在骨組織中，則可能需要較長(zhǎng)的觀察期才能達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，須基于個(gè)案處理原則。而對(duì)于可降解材料，組織反應(yīng)的穩(wěn)定狀態(tài)通常取決于納米材料在組織中的降解特性。納米材料在降解過(guò)程中可能與局部組織持續(xù)發(fā)生相互作用，故需要監(jiān)測(cè)更多的觀察周期以覆蓋典型的組織變化節(jié)點(diǎn)，還應(yīng)關(guān)注所產(chǎn)生納米顆粒在局部沉積引起的局部組織學(xué)效應(yīng)，以及向引流淋巴結(jié)遷移及進(jìn)入血液引發(fā)全身效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

盡管GB/T 16886.6不用于全身毒性、致癌性、致畸性或致突變性的評(píng)估，但如果在植入研究過(guò)程中，同步滿足了GB/T 16886.11全身毒性的要求，則可以進(jìn)行局部反應(yīng)和全身反應(yīng)的聯(lián)合研究。

（十）亞慢性毒性試驗(yàn)

GB/T 16886.11中提供了醫(yī)療器械在適當(dāng)?shù)谋┞锻緩胶蜁r(shí)間的多次接觸毒性試驗(yàn)方法。由于醫(yī)療器械涉及的材料類型多、形態(tài)復(fù)雜、預(yù)期用途范圍廣等特點(diǎn)，故在全身毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)根據(jù)納米材料的特性考慮特定的方法。

應(yīng)當(dāng)考慮臨床預(yù)期用途/適用范圍、終產(chǎn)品狀態(tài)、暴露特征等因素，在最恰當(dāng)?shù)臈l件下開展亞慢性毒性試驗(yàn)，以便模擬人體暴露情況。如直接應(yīng)用終產(chǎn)品不可行，應(yīng)使用終產(chǎn)品的代表性樣品進(jìn)行測(cè)試。

短期的亞慢性毒性試驗(yàn)可提供初步的劑量探索和毒代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，用以發(fā)現(xiàn)重點(diǎn)關(guān)注的靶器官。亞慢性毒性試驗(yàn)可設(shè)置衛(wèi)星組進(jìn)行伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究，也可單獨(dú)開展毒代動(dòng)力學(xué)研究。對(duì)于經(jīng)血液接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，最低要求是改良的28天毒性試驗(yàn)，對(duì)于其他途徑接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，最低要求是改良90天毒性試驗(yàn)，并應(yīng)根據(jù)所研究的納米材料特性及臨床接觸時(shí)間，評(píng)估28天或90天試驗(yàn)是否足夠。在該試驗(yàn)中，除了關(guān)注一般全身毒性反應(yīng)外，還應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注心血管系統(tǒng)（如納米尺度團(tuán)聚物在血管內(nèi)形成）、炎癥指標(biāo)、涉及吞噬系統(tǒng)的組織/器官（如肝、脾、腎、骨髓和肺等），以及需要盡可能評(píng)估納米材料的潛在神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性或內(nèi)分泌介導(dǎo)效應(yīng)，進(jìn)行初步危害表征和危害評(píng)估，為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供信息，為進(jìn)一步深入研究提供依據(jù)。與組織、器官存在長(zhǎng)期、持久接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，需要重點(diǎn)關(guān)注接觸組織、器官的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)，如與生殖器官、胚胎或胎兒長(zhǎng)期或持久接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，可能需要重點(diǎn)關(guān)注潛在的生殖發(fā)育毒性風(fēng)險(xiǎn)。

（十一）需要附加考慮的試驗(yàn)

1. 慢性毒性/致癌性試驗(yàn)

慢性毒性試驗(yàn)：GB/T 16886.11的一般性原則也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，建議結(jié)合納米材料特性進(jìn)行試驗(yàn)。

致癌性試驗(yàn)：GB/T 16886.3描述了致癌性試驗(yàn)的一般要求。醫(yī)療器械中使用的常規(guī)材料已經(jīng)有相關(guān)知識(shí)，很少考慮開展致癌性研究，而納米材料的相關(guān)信息有限，應(yīng)基于個(gè)案處理原則進(jìn)行試驗(yàn)。若應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械遺傳毒性試驗(yàn)陽(yáng)性，降解周期超過(guò)30天或與人體持久接觸時(shí)，應(yīng)結(jié)合納米材料和/或其浸提物潛在暴露信息、人體使用史等論證開展致癌性試驗(yàn)的必要性和合理性。

最常見的評(píng)估化學(xué)品致癌潛力的體內(nèi)試驗(yàn)是：

a) 致癌性試驗(yàn) [EC B.32, OECD 451]；

b) 慢性毒性/致癌性聯(lián)合試驗(yàn) [EC B.33, OECD 453]；

慢性毒性和致癌性研究一般是在單一物種中進(jìn)行，通常選擇大鼠，可以單獨(dú)進(jìn)行研究，也可聯(lián)合進(jìn)行，若聯(lián)合研究，應(yīng)特別注意劑量是合適的，確保到研究終點(diǎn)時(shí)存活動(dòng)物的數(shù)據(jù)可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)首選物種出現(xiàn)可疑結(jié)果或者特定發(fā)現(xiàn)，或需要專門研究所觀察到的毒性或者致癌性的作用機(jī)制時(shí)，則需要進(jìn)行第二個(gè)物種的致癌性研究。

2. 生殖和發(fā)育毒性試驗(yàn)

GB/T 16886.3關(guān)于生殖和發(fā)育毒性的策略也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。

亞慢性毒性試驗(yàn)及毒代動(dòng)力學(xué)研究可獲得應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的生殖系統(tǒng)毒性信息，如對(duì)生殖器官的影響、生殖器官中納米材料分布和蓄積等特征、動(dòng)情周期（如果需要）、性激素（如果需要）的影響等，但不能評(píng)估對(duì)生育力和整個(gè)生殖周期（從性成熟到受孕、妊娠、分娩和分娩后發(fā)育）的影響，即發(fā)育毒性。建議根據(jù)層級(jí)2中改良亞慢性毒性試驗(yàn)的毒性特征及暴露情況，綜合考慮是否在層級(jí)3中開展生殖和發(fā)育毒性試驗(yàn)。若應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械已有信息顯示具有一定生殖和發(fā)育毒性風(fēng)險(xiǎn)，需要進(jìn)行試驗(yàn)，可先進(jìn)行OECD 421，以提供可能影響生殖和（或）發(fā)育的初步信息。

在缺乏證據(jù)可以排除生殖/發(fā)育風(fēng)險(xiǎn)的情況下，應(yīng)考慮進(jìn)行生殖和發(fā)育毒性試驗(yàn)。需按照OECD 414 （胎兒發(fā)育毒性試驗(yàn)）, OECD 415 （一代生殖毒性試驗(yàn)）, OECD 416 （二代生殖毒性試驗(yàn)）開展試驗(yàn)，并對(duì)方法的適用性進(jìn)行個(gè)案處理。

若需評(píng)價(jià)子代發(fā)育毒性，可在一代生殖毒性試驗(yàn)中結(jié)合生殖系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和行為學(xué)研究、免疫系統(tǒng)發(fā)育、內(nèi)分泌研究等數(shù)個(gè)毒性終點(diǎn)，評(píng)估妊娠期、哺乳期和青春期的暴露對(duì)生育和生殖功能的短期到長(zhǎng)期的影響，以及對(duì)離乳前仔代和離乳后仔代的影響。當(dāng)需要充分表征人體暴露風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，可能需要考慮評(píng)估到F2代。

生殖/發(fā)育毒性試驗(yàn)注意事項(xiàng)：

a. 一般使用臨床暴露途徑，并基于個(gè)案分析原則，考慮暴露途徑的可行性。如宮內(nèi)節(jié)育器等醫(yī)療器械，若直接采用臨床暴露途徑可能會(huì)影響動(dòng)物受孕以及胎仔發(fā)育；腹膜內(nèi)接觸可能導(dǎo)致納米材料直接注射到子宮或穿過(guò)子宮壁，影響發(fā)育中的胚胎/胎兒；壓力環(huán)境及每天超過(guò)6小時(shí)不進(jìn)食水，導(dǎo)致經(jīng)鼻吸入暴露途徑不適用于懷孕雌性動(dòng)物。

b.建議盡可能開展伴隨毒代動(dòng)力學(xué)研究，如在發(fā)育毒性研究中，納米材料可能經(jīng)母乳暴露于子代，故應(yīng)對(duì)母乳中納米材料進(jìn)行定性和定量分析。

3. 免疫毒性

免疫反應(yīng)在層級(jí)2的研究中可能會(huì)被擴(kuò)大或首次出現(xiàn)，評(píng)價(jià)納米材料對(duì)免疫系統(tǒng)的作用可以基于層級(jí)2中的試驗(yàn)結(jié)果對(duì)免疫毒性進(jìn)行綜合評(píng)估，在個(gè)案處理原則上考慮層級(jí)3的試驗(yàn)內(nèi)容。

在亞慢性和慢性毒性試驗(yàn)中，通常提供血液學(xué)和血生化數(shù)據(jù)，以及脾細(xì)胞和/或骨髓細(xì)胞的表型分析（T-、B-、NK細(xì)胞）。EOGRTS試驗(yàn)需設(shè)置額外的組用于評(píng)估暴露對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育的潛在影響，并提供免疫球蛋白IgM對(duì)T細(xì)胞依賴抗原（如綿羊紅細(xì)胞(SRBC)或血藍(lán)蛋白 (KLH)）反應(yīng)的信息。

如果需要進(jìn)一步評(píng)估應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的免疫毒性，可采用體外模型評(píng)估免疫細(xì)胞的吞噬功能、趨化性、炎性因子、一氧化氮產(chǎn)生和信號(hào)通路等指標(biāo)。建議采用證據(jù)權(quán)重方法綜合評(píng)估應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的免疫毒性風(fēng)險(xiǎn)。

4. 神經(jīng)毒性

應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的潛在神經(jīng)毒性信息可從改良的亞慢性毒性試驗(yàn)中獲得，相關(guān)指標(biāo)包括臨床體征的改變、功能性觀察組合試驗(yàn)（FOB）和自主活動(dòng)、腦臟器系數(shù)（在沒(méi)有明顯毒性的情況下），以及神經(jīng)系統(tǒng)組織病理學(xué)改變等，如有必要，可增加神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及炎癥因子等指標(biāo)。其他如體外神經(jīng)毒性試驗(yàn)、交叉參照或提示具有神經(jīng)毒性潛能的物理化學(xué)性質(zhì)等信息也應(yīng)予以綜合考慮。

層級(jí)2發(fā)現(xiàn)潛在神經(jīng)毒性時(shí)，應(yīng)基于個(gè)案處理原則考慮在層級(jí)3進(jìn)行深入的神經(jīng)毒性試驗(yàn)，從而確認(rèn)或表征納米材料誘發(fā)的神經(jīng)毒性反應(yīng)。在設(shè)計(jì)這些研究時(shí)也應(yīng)充分考慮其他試驗(yàn)的信息，以盡量減少全身毒性繼發(fā)的效應(yīng)。在完成風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，還可以進(jìn)行機(jī)制研究，以提高從動(dòng)物到人體的外推把握度。

5. 內(nèi)分泌介導(dǎo)效應(yīng)

納米材料可能對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，特別是對(duì)生殖系統(tǒng)，可能改變激素水平，還可能具有性別差異。改良的亞慢性毒性試驗(yàn)可用于研究?jī)?nèi)分泌干擾效應(yīng)，應(yīng)關(guān)注內(nèi)分泌相關(guān)毒性終點(diǎn)（如甲狀腺激素的測(cè)定、內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的大體解剖檢查和組織病理學(xué)檢查、動(dòng)情周期檢查等）。