附件：腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑（高通量測(cè)序法）性能評(píng)價(jià)通用注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2019年第83號(hào)）.doc

腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑（高通量測(cè)序法）性能評(píng)價(jià)通用注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是針對(duì)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是對(duì)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則所述腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)主要是指基于高通量測(cè)序（high-throughput sequencing）即下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS），又稱為大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel sequencing，MPS），體外檢測(cè)人體組織腫瘤細(xì)胞中的腫瘤相關(guān)基因變異。用于檢測(cè)體細(xì)胞突變的NGS正在廣泛用于腫瘤診療相關(guān)的分子檢測(cè)，包括對(duì)特定基因的DNA/RNA進(jìn)行測(cè)序，以尋找與腫瘤臨床診療相關(guān)的基因變異。腫瘤基因突變類型包括點(diǎn)突變、插入、缺失、基因重排、拷貝數(shù)異常等廣義的基因突變。

基于NGS測(cè)序原理的體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）檢測(cè)可能包括以下步驟：樣本收集、處理和保存、核酸提取及處理、文庫(kù)制備、測(cè)序和堿基識(shí)別、序列比對(duì)、變異識(shí)別和過(guò)濾、變異注釋和解讀以及檢測(cè)報(bào)告的生成。同時(shí)，某些產(chǎn)品還可能會(huì)包括軟件部分，但上述相關(guān)步驟并不一定被全部包括，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品的具體設(shè)計(jì)流程來(lái)進(jìn)行判斷。對(duì)于每個(gè)檢測(cè)步驟，申請(qǐng)人需要結(jié)合產(chǎn)品設(shè)計(jì)和臨床意義來(lái)建立特定的可接受的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)和合格判斷標(biāo)準(zhǔn)。此外，為滿足產(chǎn)品特定預(yù)期用途，申請(qǐng)人需通過(guò)科學(xué)和適當(dāng)?shù)臋z測(cè)性能研究來(lái)確定適用的試劑、消耗品、儀器和軟件?；谏鲜隹紤]因素，NGS檢測(cè)產(chǎn)品的設(shè)計(jì)和工作流程中的任何差異均可能導(dǎo)致結(jié)果的不同，因此申請(qǐng)人需要清楚地描述相關(guān)檢測(cè)性能指標(biāo)。

分析性能評(píng)價(jià)的初衷在于提出產(chǎn)品性能有效性、安全性相關(guān)問(wèn)題的假設(shè)，然后通過(guò)研究進(jìn)行確認(rèn)。NGS在測(cè)序通量及發(fā)現(xiàn)未知基因變異方面具有優(yōu)勢(shì)，但是在NGS技術(shù)應(yīng)用需求及使用中存在包括相關(guān)臨床樣本收集處理、NGS檢測(cè)內(nèi)容、測(cè)序流程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等各方面的挑戰(zhàn)。

本指導(dǎo)原則將重點(diǎn)關(guān)注實(shí)體瘤中檢測(cè)具有臨床意義的體細(xì)胞變異和確保高質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果。申請(qǐng)人應(yīng)以患者的利益為中心，充分整合臨床腫瘤學(xué)家對(duì)于精準(zhǔn)診治的觀點(diǎn)，并充分考慮在我國(guó)推廣應(yīng)用的可操作性。申請(qǐng)人可采用多樣化的靶向基因組合檢測(cè)。由靶向基因產(chǎn)生的信息可能會(huì)被用于診斷分類，指導(dǎo)治療決策，和/或?yàn)樘囟[瘤提供預(yù)后評(píng)價(jià)，不同產(chǎn)品包含的基因數(shù)量可能存在較大差異。

本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。本指導(dǎo)原則不適用于全外顯子檢測(cè)、腫瘤全基因組測(cè)序、從頭測(cè)序、游離DNA檢測(cè)、RNA直接測(cè)序、病原體微生物及宏基因組學(xué)測(cè)序、胚胎植入前檢測(cè)、疾病風(fēng)險(xiǎn)（含遺傳風(fēng)險(xiǎn)）評(píng)估與預(yù)測(cè)、直接面向消費(fèi)者測(cè)序及健康人群篩查。

二、NGS性能評(píng)價(jià)

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說(shuō)明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容。

申請(qǐng)人在計(jì)劃開(kāi)發(fā)一個(gè)有針對(duì)性的基因檢測(cè)試劑時(shí)，需確定其預(yù)期用途、待測(cè)基因數(shù)量、檢測(cè)突變位點(diǎn)或者突變類型，包括將要檢測(cè)的樣本類型、適用人群以及哪些類型的檢測(cè)信息將被評(píng)估和報(bào)告。還應(yīng)考慮影響檢測(cè)的設(shè)計(jì)、驗(yàn)證和質(zhì)量控制的其他因素，并在試劑組成說(shuō)明書中詳細(xì)說(shuō)明該產(chǎn)品包含的試劑組分及需要但未提供的試劑、設(shè)備及耗材。

作為IVD檢測(cè)一般原則，申請(qǐng)人應(yīng)首先定義申報(bào)產(chǎn)品的預(yù)期用途和檢測(cè)性能，產(chǎn)品的預(yù)期用途將直接影響檢測(cè)設(shè)計(jì)和檢測(cè)性能以及測(cè)序和/或報(bào)告的基因類型。申請(qǐng)人需要前瞻性地確定應(yīng)進(jìn)行的研究指標(biāo)（例如準(zhǔn)確性）以及每種研究指標(biāo)應(yīng)該滿足的標(biāo)準(zhǔn)。在設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)完成之后，驗(yàn)證研究其是否滿足預(yù)定義的性能。如果檢測(cè)不符合任何預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)分析原因、重新驗(yàn)證或修改預(yù)定義的性能指標(biāo)。通過(guò)反復(fù)的設(shè)計(jì)、開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證，直到檢測(cè)滿足設(shè)定需求。在整個(gè)過(guò)程中申請(qǐng)人需要記錄所有研究方案、研究過(guò)程和結(jié)果以及每項(xiàng)研究設(shè)計(jì)的理由。建議申請(qǐng)人列出樣本處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、生信分析等環(huán)節(jié)主要質(zhì)量控制參數(shù)。如文庫(kù)濃度及片段長(zhǎng)度、堿基識(shí)別質(zhì)量值（Base Call Quality scores）、過(guò)濾后有效Reads數(shù)、有效測(cè)序深度（如經(jīng)過(guò)去重處理等）、符合最低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度要求的區(qū)域（%）等。

申請(qǐng)人應(yīng)提供整個(gè)檢測(cè)流程的標(biāo)準(zhǔn)操作程序文件（Standard Operating Procedure，SOP），對(duì)NGS技術(shù)檢測(cè)全過(guò)程包括的樣本收集處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等過(guò)程進(jìn)行描述。生物信息學(xué)分析方面描述和記錄數(shù)據(jù)處理和分析，包括變異識(shí)別、過(guò)濾和注釋的所有過(guò)程。明確所有要使用的軟件，包括來(lái)源（例如：內(nèi)部開(kāi)發(fā)以及第三方）以及主要修改。建議以列表形式描述所有需要的軟件和/或數(shù)據(jù)庫(kù)名稱、版本及其功能。

（二）主要原材料的研究資料

NGS檢測(cè)過(guò)程主要包括樣本收集處理、文庫(kù)制備、測(cè)序、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報(bào)告等。

1.樣本收集處理（如適用）

樣本收集處理過(guò)程是保證樣本具有能如實(shí)反映患者體征的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。申請(qǐng)人需提交涉及樣本收集及處理相關(guān)試劑主要原材料信息，如樣本前處理試劑、樣本運(yùn)輸保存試劑、核酸提取試劑的主要組成成分等。

2.文庫(kù)制備及測(cè)序

測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序過(guò)程中所需試劑主要包含脫氧核糖核苷三磷酸、連接酶、聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、引物、探針、接頭等；如為申請(qǐng)人自行研究的主要原材料，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的實(shí)驗(yàn)過(guò)程予以詳述；并提供對(duì)各主要原材料的功能性研究。并對(duì)制備完成的原料成品進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)以確認(rèn)其符合標(biāo)準(zhǔn)要求，且整個(gè)生產(chǎn)工藝應(yīng)穩(wěn)定可控。如為申請(qǐng)人外購(gòu)的主要原材料，應(yīng)詳述每一種原材料外購(gòu)方來(lái)源，提交外購(gòu)方出具的每種原材料性能指標(biāo)及質(zhì)量控制資料，并詳述申請(qǐng)人對(duì)外購(gòu)主要原材料的各指標(biāo)質(zhì)量要求以及確定該原材料作為本產(chǎn)品主要原材料的詳細(xì)依據(jù)。核酸類檢測(cè)試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無(wú)脫氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease,DNase）和核糖核酸酶（Ribonuclease，RNase）污染。

3.生物信息分析及數(shù)據(jù)庫(kù)要求

NGS的數(shù)據(jù)分析流程或生物信息學(xué)流程一般可以分為堿基識(shí)別、序列比對(duì)、變異識(shí)別和變異注釋等。明確參考序列類型，不同突變類型可能需要開(kāi)發(fā)不同的變異/突變檢測(cè)算法。其次，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品設(shè)計(jì)類型提供軟件工具的范圍和所需的驗(yàn)證類型。如涉及數(shù)據(jù)庫(kù)使用，建議申請(qǐng)人提交數(shù)據(jù)庫(kù)的溯源信息、數(shù)據(jù)庫(kù)類型、完整性、實(shí)時(shí)性、維護(hù)以及分析軟件的版本、性能驗(yàn)證等資料。

4.參考品要求

內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測(cè)值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇、制備過(guò)程、定值研究及評(píng)價(jià)指標(biāo)等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部陽(yáng)性/陰性參考品的來(lái)源、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行驗(yàn)證，并提供參考品溯源過(guò)程的測(cè)量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

具體要求如下：

4.1陽(yáng)性參考品及陽(yáng)性質(zhì)控品：

4.1.1陽(yáng)性參考品

理想狀態(tài)下，陽(yáng)性參考品應(yīng)當(dāng)包括對(duì)所申報(bào)產(chǎn)品每個(gè)基因型的質(zhì)控樣本。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測(cè)基因數(shù)量較多，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途、臨床意義及基因類型等因素進(jìn)行針對(duì)性和代表性的設(shè)計(jì)。

對(duì)于有明確腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因，應(yīng)考慮該類基因參考品設(shè)置的合理性和完整性，需包括伴隨診斷相關(guān)的全部熱點(diǎn)基因，建議采用臨床樣本或細(xì)胞系提取的核酸儲(chǔ)備液作為原料。

對(duì)于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因，應(yīng)考慮代表性問(wèn)題，明確具有臨床診斷意義的基因類型及基因型中不同的變異類型。突變頻率、變異類型的選取應(yīng)具有代表性，包括不同外顯子，不同基因變異突變等。

如檢測(cè)編碼區(qū)較大且存在非熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)（如大于1M），建議在陽(yáng)性參考品中考慮對(duì)檢測(cè)整體區(qū)域的靈敏度驗(yàn)證（主要關(guān)注SNV等），如混合的永生化正常人白細(xì)胞DNA儲(chǔ)存液等。

不同突變/變異的變異豐度及突變頻率，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進(jìn)行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)。申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)陽(yáng)性參考品時(shí)可一并考慮檢測(cè)限參考品的設(shè)置及確認(rèn)方式，并提供相關(guān)的依據(jù)。

4.1.2陽(yáng)性質(zhì)控品

模擬病人樣本的目標(biāo)核酸序列，并用于質(zhì)控整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，包括核酸提?。ㄈ邕m用）、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。目前陽(yáng)性質(zhì)控檢測(cè)和分析過(guò)程應(yīng)與臨床樣本方式一致。

4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品

陰性參考品及陰性質(zhì)控品建議為正常臨床樣本的混合物或細(xì)胞系，應(yīng)明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因。

4.3精密度參考品

精密度參考品設(shè)置要求可參考陽(yáng)性/陰性參考品。

4.4 PCR 試劑無(wú)模板質(zhì)控品（No Template Control，NTC）（如適用）

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品特點(diǎn)設(shè)置NTC質(zhì)控品及檢測(cè)接受標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)測(cè)檢測(cè)過(guò)程中是否存在污染。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

NGS檢測(cè)是一個(gè)復(fù)雜的工作流程，它由很多獨(dú)立步驟組合而成。一般而言，對(duì)于每個(gè)檢測(cè)組成部分，申請(qǐng)人應(yīng)建立其特定檢測(cè)的指標(biāo)和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。必須對(duì)NGS每個(gè)操作流程的性能表現(xiàn)進(jìn)行一個(gè)內(nèi)部的驗(yàn)證。每步流程都需要分別優(yōu)化到一個(gè)最佳經(jīng)驗(yàn)值，以此來(lái)綜合決定最佳的實(shí)驗(yàn)操作條件及各參數(shù)的設(shè)置。

1.應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求。

2.主要生產(chǎn)工藝、反應(yīng)原理介紹。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程（如涉及）及最佳反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleotide triphosphate，dNTP）濃度、陽(yáng)離子濃度等。

3.申報(bào)產(chǎn)品如包含核酸分離/純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸分離/純化過(guò)程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。如包括但不限于核酸體積、質(zhì)量、濃度、純度及完整性等。核酸濃度、純度檢測(cè)方法包括但不限于熒光法等；核酸完整性檢測(cè)方法包括但不限于瓊脂糖凝膠法等。

（四）分析性能評(píng)估資料

分析性能評(píng)估是反映產(chǎn)品主要原材料選擇，生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系等多方面因素設(shè)置是否合理的客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。檢測(cè)試劑性能的研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的反應(yīng)原理，臨床預(yù)期用途，使用條件等綜合因素進(jìn)行設(shè)計(jì)。性能研究應(yīng)涵蓋產(chǎn)品研制階段對(duì)試劑盒進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。

本部分內(nèi)容將從NGS檢驗(yàn)流程中的質(zhì)量控制要求和主要性能指標(biāo)兩部分進(jìn)行闡述：

1.NGS檢驗(yàn)流程

檢測(cè)方法中，應(yīng)明確所有檢測(cè)要素（如儀器、軟件、消耗品、試劑）。確定設(shè)計(jì)方案和標(biāo)準(zhǔn)并詳細(xì)記錄設(shè)計(jì)研究過(guò)程。對(duì)于基于NGS的檢測(cè)的每個(gè)組成，應(yīng)該確定規(guī)范并記錄。記錄每個(gè)檢測(cè)組成對(duì)于關(guān)鍵因素（如覆蓋率、堿基質(zhì)量等）的局限性。確定并記錄基因組的檢測(cè)區(qū)域，包括基因和變異類型，如果關(guān)鍵的測(cè)序區(qū)域不符合最低性能要求（如最小覆蓋標(biāo)準(zhǔn)等），則應(yīng)修改檢測(cè)并重新驗(yàn)證以達(dá)到最低性能要求。同時(shí)，應(yīng)在產(chǎn)品說(shuō)明書和/或標(biāo)簽中明確可能影響或限制產(chǎn)品檢測(cè)性能情形。

1.1樣本制備

申請(qǐng)人需考慮可接受檢測(cè)的樣本類型對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，應(yīng)明確組織樣本采集標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。用于腫瘤組織突變基因檢測(cè)的標(biāo)本，在進(jìn)行檢測(cè)前，須對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。腫瘤細(xì)胞所占比例需達(dá)到后續(xù)檢測(cè)方法的要求。

在NGS檢測(cè)試劑的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)過(guò)程中，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)配套使用的核酸提取、分離、純化及富集試劑進(jìn)行驗(yàn)證并提供驗(yàn)證方案的依據(jù)，應(yīng)明確樣品質(zhì)量（包括但不限于核酸濃度、純度及完整性）的最低要求并進(jìn)行質(zhì)量控制。如分離/純化后的核酸儲(chǔ)備液質(zhì)量（如濃度范圍）不符合要求，應(yīng)重新取材或擴(kuò)大樣本量再進(jìn)行核酸分離/純化。

1.2測(cè)序文庫(kù)制備

文庫(kù)制備是產(chǎn)生特定大小范圍的DNA或cDNA片段的過(guò)程。文庫(kù)質(zhì)量非常重要，申請(qǐng)人應(yīng)建立文庫(kù)構(gòu)建濃度、文庫(kù)片段大小要求，文庫(kù)濃度檢測(cè)方法包括但不限于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法；文庫(kù)片段大小檢測(cè)方法包括但不限于毛細(xì)管電泳法等。申請(qǐng)人應(yīng)關(guān)注不同測(cè)序平臺(tái)的性能特點(diǎn)，確保片段長(zhǎng)度分布符合后續(xù)測(cè)序要求。如需要進(jìn)行片段化處理。申請(qǐng)人應(yīng)制定核酸序列片段化操作流程及質(zhì)量控制方案。對(duì)經(jīng)過(guò)片段化的核酸短序列的濃度及片段分布等參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

文庫(kù)制備的關(guān)鍵步驟是在DNA片段的兩端連接測(cè)序接頭，接頭序列是一段人為設(shè)計(jì)的序列，包含用于測(cè)序過(guò)程的多個(gè)目的的多個(gè)序列組分。如啟動(dòng)測(cè)序反應(yīng)的通用測(cè)序引物序列，用于PCR擴(kuò)增引物序列、錨定序列、索引（條形碼）序列等。如申請(qǐng)人采用自定義序列，應(yīng)提供設(shè)計(jì)依據(jù)及研究資料。加接頭可以是獨(dú)立的步驟，也可以在靶向序列富集過(guò)程中添加。申請(qǐng)人使用條碼或標(biāo)簽時(shí)，需充分驗(yàn)證并滿足測(cè)序的質(zhì)量要求，如測(cè)序深度、覆蓋度等條件。申請(qǐng)人應(yīng)報(bào)告有效的條碼或標(biāo)簽數(shù)量，并對(duì)每個(gè)條碼或標(biāo)簽的序列及其位置有詳細(xì)、清晰的記錄。

1.3測(cè)序及堿基讀取

目前可用的測(cè)序平臺(tái)具有不同的測(cè)序方法，包括聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法、邊合成邊測(cè)序和離子半導(dǎo)體測(cè)序，以及不同的檢測(cè)方法。盡管技術(shù)性能相似，但平臺(tái)之間存在差異，特別是不同的DNA輸入量要求、不同的測(cè)序通量、運(yùn)行時(shí)間、測(cè)序讀長(zhǎng)和不同的堿基識(shí)別技術(shù)。這些差異會(huì)影響儀器處理低質(zhì)量樣本的能力、檢測(cè)插入/缺失/融合等變異類型的能力以及樣本通量。

申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)所選用的測(cè)序平臺(tái)，選擇合適的參數(shù)指標(biāo)對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控，制定相應(yīng)的管理制度及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并明確失控情況下的糾正措施。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用情況，如測(cè)序區(qū)域的大小及序列特征等因素確定測(cè)序所需要的覆蓋度及深度。在測(cè)序過(guò)程中，申請(qǐng)人應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案監(jiān)控整個(gè)測(cè)序過(guò)程中的測(cè)序質(zhì)量。

申請(qǐng)人應(yīng)描述清晰，如在確立測(cè)序深度時(shí)需要明確指出是平均測(cè)序深度還是最低測(cè)序深度；還需要說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)類型，如原始測(cè)序數(shù)據(jù)（原始reads數(shù)）、過(guò)濾之后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)或去除重復(fù)之后的測(cè)序深度。

堿基識(shí)別是指識(shí)別一段基因序列片段每一個(gè)位點(diǎn)的核苷酸的過(guò)程。不同測(cè)序平臺(tái)具有不同的測(cè)序偏好性，可影響堿基讀取過(guò)程中的錯(cuò)誤類型與比率。堿基讀取后，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)每個(gè)堿基讀取的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。

1.4生物信息學(xué)分析

申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)生物信息學(xué)分析流程有完整的記錄，建立完善的生物信息學(xué)分析軟件的版本控制方案。申請(qǐng)人應(yīng)建立生物信息學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案，保證測(cè)序數(shù)據(jù)的分析、解讀及報(bào)告的準(zhǔn)確性與嚴(yán)謹(jǐn)性。生物信息學(xué)分析流程應(yīng)描述清晰，包括每一步驟使用軟件的名稱、版本、參數(shù)設(shè)置要求，包括但不限以下指標(biāo)：說(shuō)明檢查每個(gè)位點(diǎn)的堿基質(zhì)量值和每個(gè)讀段的平均質(zhì)量值，堿基的頻率分布，讀長(zhǎng)分布及是否存在重復(fù)序列和人工序列的評(píng)價(jià)方法，以保證按照該流程生物信息學(xué)分析結(jié)果可復(fù)現(xiàn)。生物信息學(xué)分析應(yīng)至少報(bào)告具有明確臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。

生物信息學(xué)分析一般包括但不限于數(shù)據(jù)預(yù)處理、數(shù)據(jù)比對(duì)及質(zhì)控、變異識(shí)別和變異注釋。根據(jù)測(cè)序類型和檢測(cè)報(bào)告的變異類型選擇生物信息流程，并考慮變異識(shí)別和評(píng)估流程過(guò)程中的限制因素以及第三方生物信息學(xué)工具對(duì)整個(gè)生物信息流程的影響。

1.4.1數(shù)據(jù)預(yù)處理：申請(qǐng)人應(yīng)說(shuō)明分析流程使用的軟件類型及數(shù)據(jù)預(yù)處理步驟。數(shù)據(jù)文件（如FASTQ格式文件）應(yīng)包含質(zhì)控參數(shù)，如每個(gè)位點(diǎn)堿基質(zhì)量值的控制參數(shù)、GC含量以及序列長(zhǎng)度分布等。明確測(cè)序堿基質(zhì)量值（Base Call Quality，如質(zhì)量值Q值得分）的閾值。明確判定實(shí)驗(yàn)有效的符合堿基質(zhì)量值的最低百分比。如采用其他方法，應(yīng)提供研究資料及選擇依據(jù)。

1.4.2數(shù)據(jù)比對(duì)及質(zhì)控：申請(qǐng)人應(yīng)提供BAM （Sequence Alignment/Map）文件生成過(guò)程軟件類型，每個(gè)樣本數(shù)據(jù)參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)以及判定實(shí)驗(yàn)有效的最低接受標(biāo)準(zhǔn)。提供參考序列的選擇依據(jù)，如為特殊序列，應(yīng)提供采用該序列的依據(jù)。

1.4.3突變分析：根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品可檢測(cè)的基因類型，申請(qǐng)人應(yīng)確認(rèn)軟件工具類型及選擇依據(jù)。明確不同基因類型質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)以及判定實(shí)驗(yàn)有效的最低接受標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.4突變注釋：申請(qǐng)人應(yīng)提供每個(gè)突變預(yù)測(cè)的功能性作用以及臨床解釋注釋的形成過(guò)程及數(shù)據(jù)來(lái)源依據(jù)。

1.5軟件研究（如適用）

根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品預(yù)期用途，可能存在一些軟件產(chǎn)品不包含在申報(bào)產(chǎn)品組成成分中，但生物信息分析過(guò)程中需要用到該軟件，則該軟件被視為檢測(cè)系統(tǒng)一部分，申請(qǐng)人應(yīng)提供該部分軟件相關(guān)適用性研究資料。

1.6 NGS數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)、傳輸與共享（如適用）

用于儲(chǔ)存原始和經(jīng)過(guò)分析后的檢測(cè)結(jié)果。建議申請(qǐng)人提交數(shù)據(jù)存儲(chǔ)中心的安全性、穩(wěn)定性、維護(hù)與升級(jí)方案以及異常情況處置方案等資料。

1.7公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用（如適用）

如申報(bào)產(chǎn)品的測(cè)序結(jié)果需要借助公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)果注釋或報(bào)告解讀，申請(qǐng)人需提供所使用的公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)在產(chǎn)品檢測(cè)中起到的作用說(shuō)明，公共/內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)類型、功能介紹、版本號(hào)、標(biāo)準(zhǔn)操作流程及質(zhì)量控制方案等。

2.主要性能指標(biāo)

分析性能驗(yàn)證包括通過(guò)一組預(yù)定義性能評(píng)價(jià)方式，以證明性能是否足以滿足其預(yù)期用途并符合預(yù)定義的性能標(biāo)準(zhǔn)。通常涉及是否符合統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)要求，或檢測(cè)是否存在與患者的疾病相關(guān)的變異等。

2.1分析性能用樣本設(shè)置要求

申請(qǐng)人應(yīng)提供用于評(píng)估各項(xiàng)性能研究的標(biāo)本數(shù)量和類型設(shè)定的依據(jù)。根據(jù)產(chǎn)品預(yù)期用途，樣本研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型。研究應(yīng)考慮與檢測(cè)適應(yīng)癥相關(guān)的臨床意義區(qū)域，跨不同基因區(qū)域的變異、難以測(cè)序或難以比對(duì)的基因區(qū)域，人工混合嵌合體以及任何其他變異類型、檢測(cè)區(qū)域。例如：如果檢測(cè)旨在用于檢測(cè)和報(bào)告插入、缺失位點(diǎn)等，應(yīng)包括但不限于不同大小的基因片段、突變所在區(qū)域等。

應(yīng)在研究中使用含有與檢測(cè)適應(yīng)癥相關(guān)的臨床樣本，臨床樣本應(yīng)具有適當(dāng)?shù)拇硇?，確保可覆蓋申報(bào)產(chǎn)品聲稱的臨床相關(guān)序列變異等。

2.2準(zhǔn)確性

2.2.1總體要求

準(zhǔn)確性包括對(duì)比檢測(cè)值與被檢測(cè)值之間一致性。對(duì)于基于NGS測(cè)序原理的檢測(cè)，通過(guò)與適當(dāng)?shù)膶?duì)比方法比較，如核酸測(cè)序或其他經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法，評(píng)估申報(bào)產(chǎn)品準(zhǔn)確性能。根據(jù)檢測(cè)的性能指標(biāo)，準(zhǔn)確性研究應(yīng)包括代表性變異和變異類型驗(yàn)證（準(zhǔn)確性研究樣本要求詳見(jiàn)2.1分析性能用樣本設(shè)置要求）。

對(duì)于每種變異類型以及代表性臨床相關(guān)變異，應(yīng)考慮變異頻率。對(duì)于變異類型，為了確定檢測(cè)的變異類型以及檢測(cè)它們的測(cè)序區(qū)域（不管變異是否具有致病性），可以使用具有代表性的參考物質(zhì)或具有高置信度的樣本進(jìn)行研究。對(duì)于臨床相關(guān)的變異，準(zhǔn)確性計(jì)算包含使用基于臨床樣本的研究數(shù)據(jù)與臨床樣本相關(guān)的指標(biāo)。

準(zhǔn)確性研究中應(yīng)含有代表性臨床相關(guān)變異與檢測(cè)適應(yīng)癥的臨床樣本，以確保臨床相關(guān)序列變異被檢測(cè)和報(bào)告。準(zhǔn)確性評(píng)估如采用前瞻性臨床樣本時(shí)，收集和處理的方式應(yīng)與產(chǎn)品預(yù)期用途一致。如果前瞻性的臨床樣本不可用，則可以使用臨床相關(guān)區(qū)域中含有特定變異的凍存臨床樣本或人類細(xì)胞系樣本替代或補(bǔ)充研究。

根據(jù)待評(píng)價(jià)方法和對(duì)比方法對(duì)所有變異的檢測(cè)結(jié)果分別計(jì)算陽(yáng)性符合率（Positive Percent Agreement，PPA）、陰性符合率（Negative Percent Agreement，NPA）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（Positive Predictive Value，PPV）。通過(guò)檢測(cè)評(píng)估的每種類型的變異，如單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Variant，SNV）、插入、結(jié)構(gòu)變異，和測(cè)序區(qū)域范圍（如高度同源、高度多態(tài)或其他困難的區(qū)域），分別計(jì)算PPA、NPA等。

表1注：PPA通過(guò)將A（真陽(yáng)性結(jié)果數(shù)）除以（A+C）、NPA通過(guò)將D（真陰性結(jié)果數(shù)）除以（B+D）。這些計(jì)算不應(yīng)包含任何無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答，無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答結(jié)果應(yīng)被單獨(dú)列出（見(jiàn)表2）。根據(jù)適用情況計(jì)算每種變體類型以及臨床相關(guān)變異PPA、NPA等。

表2注：準(zhǔn)確性研究中無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答的百分比應(yīng)該被估計(jì)為（E + F）/ N以及95％的雙側(cè)置信區(qū)間。此外，應(yīng)評(píng)價(jià)陽(yáng)性結(jié)果中的無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答E /（A + C + E）和陰性結(jié)果中的無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答F /（B + D + F）。申請(qǐng)人應(yīng)設(shè)定無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答的最小可接受標(biāo)準(zhǔn)并提供依據(jù)。樣本總數(shù)（N = A + B + C + D + E + F）。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答產(chǎn)生原因進(jìn)行分析，注意區(qū)分無(wú)應(yīng)答或無(wú)效結(jié)果與模棱兩可結(jié)果，如質(zhì)控正常但結(jié)果無(wú)法識(shí)別的情況等。

2.2.2參考品準(zhǔn)確性

各水平、各突變位點(diǎn)的陽(yáng)性參考品均應(yīng)按要求檢出陽(yáng)性，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同，應(yīng)對(duì)各水平陽(yáng)性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；陰性參考品在各個(gè)引物探針組合的檢測(cè)條件下均應(yīng)檢出為陰性。

2.3檢測(cè)限

明確可接受的最低檢測(cè)限（Limit of Detection，LoD），并明確無(wú)效應(yīng)答或無(wú)應(yīng)答檢測(cè)結(jié)果的可接受標(biāo)準(zhǔn)。為預(yù)期用途中包含的每種變異類型建立LoD。如果檢測(cè)人工混合的樣本（如嵌合樣本），需要考慮不同的等位基因比率，確定檢測(cè)限。

試劑LoD的研究中應(yīng)在常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室條件和確定的樣本類型下進(jìn)行。通常，LoD值采用分析物最低濃度計(jì)算得出，在此濃度下，可從相應(yīng)檢測(cè)重復(fù)中獲得至少95%的陽(yáng)性檢出和可接受水平的無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答。當(dāng)不同的變異類型可能具有不同的LoD時(shí)，需要計(jì)算不同的序列被測(cè)區(qū)域范圍中的每個(gè)變異類型的LoD。NGS檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)多種類型突變基因，因此靈敏度的設(shè)置應(yīng)根據(jù)不同突變基因類型及判讀方式進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4空白限（檢測(cè)基線）

應(yīng)確認(rèn)不會(huì)對(duì)報(bào)告區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)或覆蓋率產(chǎn)生負(fù)面影響。應(yīng)包含具有代表性的基因區(qū)域、變異類型和序列背景進(jìn)行驗(yàn)證研究。設(shè)置空白檢測(cè)限檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定評(píng)價(jià)方案及方法。

2.5分析特異性

分析特異性是評(píng)估產(chǎn)品僅可檢測(cè)到預(yù)期待測(cè)變異的能力。根據(jù)預(yù)期用途和產(chǎn)品設(shè)計(jì)，一些潛在的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)干擾和交叉反應(yīng)或交叉污染可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品檢測(cè)性能產(chǎn)生影響。

交叉反應(yīng)（如同源區(qū)域、假基因和其他類型的交叉反應(yīng)序列）可能導(dǎo)致錯(cuò)誤檢測(cè)，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果?；颊邩?biāo)本的交叉污染可能將其他不正常的序列引入到檢測(cè)中，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。因此，應(yīng)選擇產(chǎn)品預(yù)期用途所覆蓋樣本或樣本類型以及DNA提取方法中相關(guān)的干擾物質(zhì)開(kāi)展研究。同時(shí)，應(yīng)對(duì)已知交叉反應(yīng)的等位基因和同源區(qū)域進(jìn)行評(píng)估。

2.6精密度

精密度研究主要是指使用相同的樣本（包括檢測(cè)臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進(jìn)行檢測(cè)（如不同操作員，不同操作條件，不同檢測(cè)天數(shù)，不同儀器等），并考慮檢測(cè)中主要的變異來(lái)源。申請(qǐng)人應(yīng)評(píng)估變異和野生型基因的精密度，其中應(yīng)分別報(bào)告不同檢測(cè)區(qū)域和變異類型的檢測(cè)值。申請(qǐng)人應(yīng)使用客觀證據(jù)和有效的統(tǒng)計(jì)方法來(lái)驗(yàn)證這些指標(biāo)設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果多樣性的主要因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括但不限于檢測(cè)多個(gè)樣本、不同檢測(cè)批間、不同適用機(jī)型、試劑批次、檢測(cè)天數(shù)和操作員。

此外，申請(qǐng)人應(yīng)考慮外部因素相同的情況下，應(yīng)進(jìn)行申報(bào)試劑在相同或相似被測(cè)物的重復(fù)性檢測(cè)以評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果。申請(qǐng)人需對(duì)每個(gè)檢測(cè)條件和檢測(cè)區(qū)域下每個(gè)變異類型精密度分別進(jìn)行報(bào)告，還應(yīng)報(bào)告無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答的百分比。

2.7體細(xì)胞與胚系突變鑒別研究（如適用）

申請(qǐng)人需提交資料明確申報(bào)產(chǎn)品如何有效鑒別胚系突變，申請(qǐng)人無(wú)論使用何種方法，都應(yīng)遵循保證準(zhǔn)確檢測(cè)的原則。如：對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)對(duì)該患者正常配對(duì)樣本（正常癌旁組織或外周血白細(xì)胞）進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)配對(duì)樣本與癌組織樣本中鑒定出的突變信息進(jìn)行鑒別篩選，應(yīng)確認(rèn)樣本中特有的基因多態(tài)性，并明確混合后的每個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的預(yù)期頻率。當(dāng)無(wú)配對(duì)樣本時(shí)，申請(qǐng)人需提供如何有效區(qū)分體細(xì)胞突變和胚系突變鑒定標(biāo)準(zhǔn)并提供相關(guān)研究資料。

2.8批次互通性（如適用）

NGS的檢測(cè)通常包括試劑，消耗品，儀器和軟件。各部分相對(duì)獨(dú)立，申請(qǐng)人需對(duì)各批次之間是否互通進(jìn)行研究。

2.9生物分析流程的性能補(bǔ)充研究（如適用）

當(dāng)臨床樣本、細(xì)胞系或生物合成材料不可用或無(wú)法完全覆蓋生物分析流程時(shí)，可以使用含有各種要求類型的已知序列變異（如：SNV、插入、缺失、結(jié)構(gòu)變異等）的計(jì)算機(jī)構(gòu)建的序列標(biāo)本。申請(qǐng)人可采用軟件編輯滿足驗(yàn)證需要的模擬樣本或數(shù)學(xué)模型，對(duì)生物分析流程進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證。這些數(shù)據(jù)文件應(yīng)使用與申報(bào)產(chǎn)品相同的預(yù)分析和分析方法來(lái)生成。需要注意，編輯樣本不能替代生物學(xué)樣本，只能作為生物學(xué)樣本不能滿足所有驗(yàn)證條件下的補(bǔ)充情形。

2.10其他

評(píng)估檢測(cè)局限性時(shí)，申請(qǐng)人應(yīng)采用特殊樣本，如大于特定大小的插入或缺失或重排，并確定檢測(cè)無(wú)法以預(yù)期的準(zhǔn)確度和精確度檢測(cè)到的序列變化類型。如果這些區(qū)域是申報(bào)產(chǎn)品檢測(cè)預(yù)期用途的一部分，則需要驗(yàn)證高度同源、高度多態(tài)或其他困難區(qū)域的變異的檢測(cè)性能。如果被檢測(cè)的基因區(qū)域的一部分難以測(cè)序并且不能達(dá)到性能閾值，則應(yīng)該將其報(bào)告為檢測(cè)局限性。如適用，申請(qǐng)人應(yīng)記錄申報(bào)產(chǎn)品不會(huì)報(bào)告的檢測(cè)類型。

在設(shè)計(jì)和驗(yàn)證過(guò)程中，申請(qǐng)人應(yīng)記錄所有檢測(cè)失敗情況并分析原因。例如，由于未能滿足其一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)運(yùn)行質(zhì)量指標(biāo)等。不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)區(qū)域不應(yīng)報(bào)告變異結(jié)果。由于未能達(dá)到檢測(cè)運(yùn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)而未被檢測(cè)到的區(qū)域，則應(yīng)如實(shí)報(bào)告。

申報(bào)產(chǎn)品上市后，通過(guò)上市后臨床數(shù)據(jù)收集和分析或藥品說(shuō)明書中明確具有伴隨診斷用途的基因，在不改變?cè)蟹磻?yīng)體系和檢測(cè)方式等情況，申請(qǐng)人可通過(guò)收集本產(chǎn)品臨床有效性資料申請(qǐng)變更其臨床用途。

三、名稱解釋

通量測(cè)序（High-throughput sequencing）：又稱下一代測(cè)序技術(shù)（Next-generation sequencing），可以一次性對(duì)數(shù)百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序。

全基因組測(cè)序：對(duì)某種生物基因組中的全部堿基進(jìn)行測(cè)序，即把細(xì)胞內(nèi)完整的基因組序列從第一個(gè)DNA分子開(kāi)始直到最后一個(gè)DNA分子完整檢出，并按順序排列。

從頭測(cè)序（de novo sequencing）：即不依賴于任何已知的基因組參考序列和其他序列信息，而直接對(duì)某個(gè)物種的全基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，然后利用生物信息學(xué)工具對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行拼接和組裝，從而獲得該基因組的全序列或連續(xù)的大片段。

永生化正常人白細(xì)胞：將正常人的白細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并通過(guò)基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)將外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突變體等，導(dǎo)入目的細(xì)胞內(nèi)以增加永生化的發(fā)生率，從而得到的永生化細(xì)胞株。

變異豐度：變異基因型在所有基因型中所占的比例，計(jì)算方式為變異基因型數(shù)量除以野生型和變異型基因總量。

變異頻率：變異基因型在總?cè)巳褐械幕蝾l率。

原始reads數(shù)：經(jīng)過(guò)高通量測(cè)序后，測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)總reads數(shù)。

有效測(cè)序深度（如經(jīng)過(guò)去重處理等）：去除PCR重復(fù)等后的平均深度。

符合最低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度要求的區(qū)域（%）：最低測(cè)序深度和平均測(cè)序深度均大于閾值的區(qū)域數(shù)與區(qū)域總數(shù)的比值。

GC含量（GC content）：在測(cè)序所得的所有堿基中G（鳥嘌呤）和C（胞嘧啶）兩種堿基數(shù)與所有堿基數(shù)的比值。

覆蓋率：測(cè)序覆蓋區(qū)域占總目標(biāo)區(qū)域的比例。

最小覆蓋標(biāo)準(zhǔn)：測(cè)序覆蓋區(qū)域占總目標(biāo)區(qū)域的最小比例閾值。

堿基識(shí)別質(zhì)量值（base call quality scores）：衡量測(cè)序質(zhì)量的重要指標(biāo)，指測(cè)序得到的堿基的可靠性程度，基因的高通量測(cè)序中，每測(cè)一個(gè)堿基會(huì)給出一個(gè)相應(yīng)的質(zhì)量值（base call quality，Q），用于衡量測(cè)序準(zhǔn)確度。質(zhì)量值越高表示堿基識(shí)別越可靠，堿基被測(cè)錯(cuò)的概率越小。

錨定序列：測(cè)序芯片上隨機(jī)分布的兩種不同的寡核苷酸序列，用于與測(cè)序文庫(kù)結(jié)合。

索引（條形碼）序列：index標(biāo)簽序列或barcode標(biāo)簽序列，指在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中引入的一段標(biāo)簽序列，用于多樣品同時(shí)測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣本的序列。    

無(wú)應(yīng)答或無(wú)效應(yīng)答：測(cè)序結(jié)果失敗或測(cè)序數(shù)據(jù)低于質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果無(wú)效。

四、參考文獻(xiàn)

1.李金明等.高通量測(cè)序技術(shù)，科學(xué)出版社 2018.12

2.王忻琨.新一代測(cè)序數(shù)據(jù)分析，科學(xué)出版社 2018.2

3.Stuart M.Brown.第二代測(cè)序信息處理，科學(xué)出版社 2017.1

4.步宏、葉豐等.臨床分子病理NGS100問(wèn)簡(jiǎn)明問(wèn)答（第一版）

5.中國(guó)食品藥品檢定研究院，第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)試劑質(zhì)量評(píng)價(jià)通用技術(shù)指導(dǎo)原則

6. EVALUATION OF AUTOMATIC CLASS III DESIGNATION FOR MSK-IMPACT （Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets）

7. The Association for Molecular Pathology，American Society of Clinical Oncology,and College of American Pathologists Standards and Guidelines for the Interpretation and Reporting of Sequence Variants in Cancer The Journal of Molecular Diagnostics，Vol. 19，No. 1，January 2017

8.Verification and Validation of Multiplex Nucleic Acid Assays；Approved Guideline. Clinical and Laboratory Standards Institute. NCCLS，MM17-A，Vol.28 No.9，ISBN 1-56238-661-1。

9.Guidelines for Diagnostic Next-Generation Sequencing. European Journal of Human Genetics，2015，24（1）：1584-1589。

10.ACMG Clinical Laboratory Standards for Next-Generation Sequencing. Genetics in Medicine，2013，15（9）。

11.Ewing AD，Houlahan KE，Hu Y，Ellrott K，Caloian C，Yamaguchi TN，Bare JC，P'ng C，Waggott D，Sabelnykova VY et al：Combining tumor genome simulation with crowdsourcing to benchmark somatic single-nucleotide-variant detection. Nature methods 2015，12（7）：623-630.

12.FDA.Considerations for Design,Development，and Analytical Validation of Next Generation Sequencing （NGS）– Based In Vitro Diagnostics （IVDs）Intended to Aid in the Diagnosis of Suspected Germline Diseases

13.FDA.Use of public human genetic variant databases to support clinical validity for genetic and genomic-based in vitro diagnostics，Document issued on April 13，2018.

14. FoundationFocus? CDxBRCA Technical Information Summary

15.中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟（CAGC），中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）二代測(cè)序（NGS）技術(shù)應(yīng)用于臨床腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷的共識(shí)第一版（試行）2016.04.23

16.中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)腫瘤標(biāo)志物專家委員會(huì)，中國(guó)腫瘤驅(qū)動(dòng)基因分析聯(lián)盟二代測(cè)序技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用專家共識(shí) 中華醫(yī)學(xué)雜志98（26）2018.7.10

五、起草單位

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心。