附件：基于核酸檢測方法的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑注冊技術審查指導原則（2019年第80號）.doc

基于核酸檢測方法的金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測試劑注冊技術審查
指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導原則是針對基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑的一般要求，申請人應依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導原則是供申請人和審查人員使用的指導性文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標準體系及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)、標準的不斷完善和科學技術的不斷發(fā)展，本指導原則相關內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、適用范圍

（一）臨床背景

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）為革蘭陽性球菌，是葡萄球菌屬的一種，分布廣泛，多種動物和人均有易感性，是臨床上常見的致病菌。隨著抗菌藥物的使用，逐漸出現(xiàn)耐藥型金黃色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA）。MRSA具有多重耐藥性，不僅對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，也對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類藥物都表現(xiàn)出不同程度的耐藥，其對不同抗菌藥物的耐藥率存在較大的地域差異，并有不同的變化趨勢。

MRSA分為醫(yī)療機構(gòu)相關性MRSA（healthcare-associated MRSA，HA-MRSA)、社區(qū)相關性MRSA ( community-associated MRSA，CA-MRSA )和家畜相關性（Livestock- associated MRSA，LA-MRSA）。CA-MRSA 和HA-MRSA 、LA-MRSA在微生物學、細菌耐藥（如HA-MRSA相較于CA-MRSA表現(xiàn)出更多多重耐藥）及臨床特點方面（如感染部位）有較大差異，根據(jù)這些特點可以將兩者進行區(qū)分。但由于人員在醫(yī)院和社區(qū)間不斷流動，CA-MRSA 和HA-MRSA 的差異日漸縮小。MRSA的分型有多種方式，如SCCmec、spa基因分型、多位點序列分型（MLST）、基于脈沖場凝膠電泳（PFGE）的分型等。

MRSA的耐藥機制可能是由于MRSA受到外界刺激后本身固有耐藥基因被激活或是引入了外來的耐藥基因并激活。目前臨床分離的MRSA菌株對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺抗菌藥物耐藥（新型頭孢菌素類除外），大部分耐藥是由mecA、mecC基因介導，但是小部分MRSA不攜帶mecA基因，存在其它耐藥機制。

目前SA的臨床檢測方法包括：分離培養(yǎng)后，經(jīng)染色觀察、血漿凝固酶試驗、生化鑒定，質(zhì)譜鑒定及聚合酶鏈反應（PCR）檢測耐熱核酸酶（nuc）基因、SA保守基因16S rRNA和SA多種毒素基因。

MRSA的檢測方法包括頭孢西丁紙片擴散法、苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法（MIC）、苯唑西林瓊脂篩選法、青霉素結(jié)合蛋白（PBP2a）乳膠凝集法、顯色培養(yǎng)基法、自動化藥敏檢測以及聚合酶鏈反應（PCR）檢測mecA等基因方法。

美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）推薦用于MRSA的檢測方法有：紙片擴散法、2%NaCl肉湯/瓊脂稀釋法和苯唑西林瓊脂篩選法，這些檢測方法均需要在33-35℃條件下孵育24小時。

目前臨床推薦選擇頭孢西丁篩查試驗進行MRSA的檢測，還可以選擇苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法（MIC）。

MRSA/SA的臨床檢測樣本類型包括但不限于鼻拭子、痰液、皮膚及軟組織感染樣本、血培養(yǎng)陽性并革蘭染色法陽性球菌的樣品等人體樣本和培養(yǎng)物。不同樣本類型可能適用于不同的臨床預期用途：如用于醫(yī)療機構(gòu)對住院病人包括重癥監(jiān)護病人、手術病人及長期護理病人等MRSA院內(nèi)感染的預防和控制的監(jiān)測，用于結(jié)合其他實驗室檢測如微生物培養(yǎng)等輔助診斷MRSA/SA的感染，用于臨床需進行培養(yǎng)檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷等。

（二）本指導原則適用范圍

本指導原則適用于基于核酸檢測方法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別檢測的體外診斷試劑。常見方法包括熒光聚合酶鏈反應（PCR）方法、基因芯片法等。本指導原則的相關內(nèi)容基于熒光聚合酶鏈反應（PCR）方法對產(chǎn)品相關申報資料提出要求，其他方法的相關產(chǎn)品可依據(jù)方法學的具體特點參照執(zhí)行。

二、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

綜述資料主要包括產(chǎn)品預期用途、產(chǎn)品描述、有關生物安全性的說明、有關產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價以及其他內(nèi)容，其中，與預期用途相關的臨床適應癥應重點描述申報產(chǎn)品所檢測的金黃色葡萄球菌鑒定基因的選擇依據(jù)、耐藥突變位點與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的相關性、基因選擇的依據(jù)及覆蓋的耐藥菌的情況、產(chǎn)品驗證覆蓋的耐藥菌株及其在我國的流行特征；產(chǎn)品描述應明確申報產(chǎn)品所有可檢出的耐藥基因型（可包含不同分型方式下的分型，如SCCmec型、spa型以及PFGE分型）、尚未驗證的耐藥菌株型別；同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準上市的情況，應著重從所檢菌株覆蓋情況、檢測的最低檢出限及不同菌株和型別間的交叉反應等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。綜述資料的撰寫應符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）和《體外診斷試劑注冊申報資料要求及說明》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）的相關要求。

（二）主要原材料研究資料

此類產(chǎn)品主要為PCR方法，主要原材料包括引物、探針、DNA聚合酶、dNTP、尿嘧啶糖基化酶（如有）、核酸分離/純化組分（如有）、試劑盒質(zhì)控品及企業(yè)參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備及質(zhì)量標準等的研究資料、質(zhì)控品的確認試驗資料；生產(chǎn)企業(yè)還應提供企業(yè)參考品的原材料選擇、來源、質(zhì)量指標、參考品的制備及陰陽性的確認過程等。

1.引物和探針：包括申報產(chǎn)品檢測靶序列的引物和探針以及內(nèi)對照的引物和探針。應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對應情況。針對檢測靶序列的引物和探針，建議設計兩套或多套引物、探針以供篩選，針對預期適用的型別進行檢出準確性和特異性（如交叉反應）的評價，可采用擴增靶序列與SA和MRSA基因組比對研究的方法，最終確認最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據(jù)。引物、探針的質(zhì)量標準應至少包括序列準確性、純度檢查、濃度檢查及功能性實驗等。

2.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其質(zhì)量標準如下：

2.1DNA聚合酶應包括DNA聚合酶活性、無核酸內(nèi)切酶活性、熱啟動能力（如適用）、熱穩(wěn)定性等。

2.2如申報產(chǎn)品中包含尿嘧啶DNA糖基化酶，應對其酶活性及熱穩(wěn)定性等質(zhì)量控制標準進行規(guī)定。

3.dNTP：質(zhì)量標準應至少包括純度檢查及功能性實驗等。

4.核酸分離/純化組分（如有）的原理介紹、主要組成、主要原材料的質(zhì)量控制標準及相關驗證資料。

5.試劑盒質(zhì)控品

試劑盒的質(zhì)控體系通過設置各種試劑盒質(zhì)控品來實現(xiàn)，針對陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，申請人應明確質(zhì)控品的來源、質(zhì)量標準、質(zhì)控品陰陽性的確認方法及相關驗證資料。質(zhì)控品應參與樣本處理和檢測的全過程，如核酸的平行提取等步驟。申報產(chǎn)品的質(zhì)控體系應考慮以下幾個方面：

5.1陽性質(zhì)控品中應含有包含試劑盒所檢靶序列的DNA，優(yōu)先使用MRSA/SA分離滅活菌株，也可以采用工程菌株、克隆菌株等。企業(yè)應對質(zhì)控品的檢測結(jié)果做出明確的范圍要求（如Ct值）。

5.2陰性質(zhì)控品應不含試劑盒所檢靶序列的基因，陰性質(zhì)控的基質(zhì)應與實際樣本基質(zhì)一致或接近，以對可能存在的交叉污染產(chǎn)生的假陽性結(jié)果進行質(zhì)量控制。

5.3對照（內(nèi)標）可以對管內(nèi)抑制導致的假陰性結(jié)果進行質(zhì)量控制，申請人應對內(nèi)對照（內(nèi)標）的引物、探針設計和模板濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內(nèi)對照的檢測結(jié)果亦應做出明確的范圍要求（如Ct值）。

6.企業(yè)參考品：應詳細說明有關企業(yè)參考品的原料選擇、制備過程、提供陰陽性確認等試驗資料。

企業(yè)參考品應充分考慮產(chǎn)品檢測靶物質(zhì)的各種基因型別和耐藥菌株，考慮產(chǎn)品驗證的性能需求進行設置。具體要求如下：

6.1陽性參考品

陽性參考品應采用經(jīng)鑒定確認的多個臨床流行分離菌株、含有菌株純化的基因組DNA等，包含申報產(chǎn)品聲稱的應檢出的MRSA/SA基因型。應覆蓋我國主要的流行耐藥菌株，可包含不同分型方式下的分型，如SCCmec型、spa型以及PFGE分型等。

6.2陰性參考品（特異性參考品）

陰性參考品應考慮檢測MRSA和SA的特異性分別進行評價的要求，應納入不在試劑盒檢測范圍內(nèi)的其他葡萄球菌、革蘭陽性菌菌株和其他病原體樣品，特別是可能存在潛在競爭抑制的甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌。

6.3檢測限參考品

檢測限參考品應分別針對MRSA和SA每個分析物靶基因和不同樣本類型設定檢測限附近連續(xù)稀釋的參考品，應使用處于對數(shù)增長期的菌進行制備，明確每個參考品的活菌數(shù)，以CFU/mL表示。應明確CFU的確定方法。

6.4精密度參考品

精密度參考品應使用菌株針對每個檢測目標物設定一組參考品，包括陰性、弱陽性（略高于臨界值，預期重復檢測95%陽性）、中等陽性（高于臨界值，預期檢測結(jié)果100%陽性）三個水平。

如產(chǎn)品適用于不同的樣本類型，建議針對不同樣本類型設定不同的參考品基質(zhì)，應與實際樣本類型基質(zhì)一致或相似，模擬基質(zhì)應經(jīng)證實與天然基質(zhì)無顯著差異。

若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定，并提交主要原材料制備過程；如主要原材料購自其他供應商，則需針對供應商的選擇提供評價數(shù)據(jù)，并提供供應商出具的質(zhì)量標準、出廠檢定報告，以及申請人對該原材料進行的質(zhì)量檢驗資料。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應體系的研究資料

1.介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可以圖表方式表示，并說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.反應原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。

4.確定最佳反應體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。

5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

6.如申報產(chǎn)品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行選擇的研究資料。

（四）分析性能評估資料

申請人應提交產(chǎn)品研制階段對試劑盒進行的所有性能評價的研究資料，對于每項分析性能的評價都應包括具體研究目的、試驗方法、可接受標準、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細資料。有關分析性能驗證的背景信息也應在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點、適用儀器、試劑規(guī)格、批號和臨床樣本來源等。

針對不同的樣本類型如鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染拭子樣本、血培養(yǎng)分離樣本等，申請人應分別完成性能評估，包括陰陽性符合率、最低檢測限、精密度評價、干擾驗證等。

分析性能評價的試驗方法可以參考相關的國外或國內(nèi)有關體外診斷試劑性能評估的指導原則進行。各項性能評價應符合以下要求。

1.核酸分離/純化性能（如適用）

在進行靶核酸檢測前，應有適當?shù)暮怂岱蛛x/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的核酸外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有核酸分離/純化的組分，企業(yè)都應結(jié)合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸分離/純化試劑針對聲稱樣本類型的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。

2.最低檢測限

申報產(chǎn)品最低檢出限的性能評估資料應包含最低檢出限的確定及驗證過程。

應使用臨床分離獲得的特征良好的MRSA/SA分離菌株進行最低檢測限研究。所選菌株建議包含來自不同地區(qū)的MRSA/SA，以涵蓋金黃色葡萄球菌的遺傳多樣性，應覆蓋不同分型方式下的不同分型，如SCCmec型、spa型、PFGE分型，涵蓋我國不同地區(qū)臨床常見型別。最低檢測限的確定研究試驗應使用上述選定的多種有代表性的MRSA/SA分離菌株進行連續(xù)稀釋，以CFU/mL為檢測單位，如引入DNA拷貝數(shù)作為單位，應確定兩者之間的換算關系。稀釋基質(zhì)應根據(jù)產(chǎn)品聲稱的樣本類型分別配合相應的基質(zhì)。如樣本類型為鼻拭子、痰液或皮膚及軟組織感染拭子，建議使用陰性鼻拭子或陰性皮膚及軟組織拭子洗液或模擬基質(zhì)進行稀釋，如可使用含生理鹽水、粘蛋白及人類基因組DNA的基質(zhì)作為鼻拭子、痰液樣本替代基質(zhì)，使用含白細胞、紅細胞、血漿的基質(zhì)作為皮膚及軟組織拭子樣本的替代基質(zhì)；如樣本類型為經(jīng)血培養(yǎng)并確定含革蘭陽性球菌（GPC）的樣本，應使用含人血液和適配的血液培養(yǎng)基作為模擬基質(zhì)，并應添加高濃度的常見感染菌。可將模擬樣本稀釋液培養(yǎng)一段時間。無論使用何種模擬或替代基質(zhì)，應進行基質(zhì)比對性試驗證明替代基質(zhì)與臨床實際樣本的等效性。

將各稀釋液重復檢測3-5次，預估檢測限范圍后制備至少20份檢測限濃度樣本，證實MRSA/SA檢出率達到95%的濃度作為最低檢測限。針對不同的血培養(yǎng)瓶或血培養(yǎng)系統(tǒng)，應分別驗證檢測限是否一致。

3.包容性

應通過實驗證實產(chǎn)品能夠檢出的金黃色葡萄球菌中存在的基因多態(tài)性的MRSA/SA。在實驗驗證菌株納入時考慮金黃色葡萄球菌的進化結(jié)構(gòu)，常見克隆系和型別，并納入不同SCCmec型、spa型、PFGE類型的菌株。建議檢索近年國內(nèi)相關文獻報道并收集各地區(qū)、不同菌株（社區(qū)和醫(yī)院內(nèi)感染，鼻腔、皮膚和軟組織感染等）進行菌株驗證。被驗證細菌的濃度應接近檢測限水平，所有菌株應進行鑒定和濃度測定。并應在預期可能存在高濃度（高于106CFU/mL）的其他感染菌如甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌情況下進行試驗。

4．申請人應對申報產(chǎn)品精密度指標做出合理要求。精密度評價使用菌株配制的企業(yè)參考品或相應臨床樣本進行，且精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

4.1對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對分析儀、操作者、地點、檢測批次等要素進行相關的驗證。

4.2設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

4.3用于精密度評價的參考品或臨床樣本均應至少包含3個水平：陰性、弱陽性（略高于臨界值，預期重復檢測95%陽性）、中等陽性（高于臨界值，預期檢測結(jié)果100%陽性），并根據(jù)產(chǎn)品特性設定適當?shù)木芏纫?，臨床樣本精密度評價中的每一次檢測均應從核酸提取開始。

5.分析特異性

5.1交叉反應

交叉反應的驗證應結(jié)合樣本來源進行，針對不同樣本類型考慮可能共生的潛在的交叉反應病原體。應使用高濃度交叉反應病原體（如高于106CFU/mL的細菌和酵母，高于105PFU/mL的病毒）進行交叉反應驗證，以明確是否存在交叉反應所致的假陽性。

針對鼻拭子、痰液樣本，應考慮在鼻中及呼吸道的致病菌和共生菌，如甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）、凝固酶陰性葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌（MRSE），以及革蘭陰性桿菌、革蘭陰性球菌、奈瑟菌、莫拉菌、酵母菌、革蘭陽性桿菌、革蘭陽性球菌等臨床常見菌種，凝固酶陽性葡萄球菌代表菌株。

針對皮膚和軟組織感染樣本或檢測來自血培養(yǎng)測定為陽性微生物生長并經(jīng)革蘭染色證實為革蘭陽性球菌的樣本，應納入更多微生物，包括皮膚菌群。對于血培瓶來源的樣本無必要進行病毒交叉反應驗證。

5.2微生物干擾

同樣采用上述潛在交叉反應微生物，評價潛在微生物干擾，即是否對MRSA/SA臨界水平樣本檢測產(chǎn)生干擾。建議采用存在于各標本類型的（鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染、血培養(yǎng)樣本）和代表不同MRSA基因型的至少兩個MRSA菌株在臨界水平進行微生物干擾試驗。

5.3干擾物質(zhì)

評價各樣本類型中可能存在的干擾物質(zhì)是否對檢測造成干擾。建議采用存在于各標本類型的（鼻拭子、痰液、皮膚和軟組織感染、血培養(yǎng)樣本）和代表不同MRSA基因型的至少兩個MRSA菌株的臨界濃度對干擾物質(zhì)（潛在最高濃度）進行驗證。鼻拭子樣本的干擾物質(zhì)應考慮血液、鼻腔分泌物或黏液、鼻腔用藥。痰液樣本的干擾物應考慮如血液、粘液、人細胞等。皮膚和軟組織感染樣本的潛在干擾物應考慮血液、膿液、血漿、常用外用抗菌藥、抗生素等皮膚用藥。血培養(yǎng)樣本的潛在干擾物質(zhì)應考慮血培養(yǎng)基、樹脂及活性炭等，具體結(jié)合培養(yǎng)瓶類型確定。

6.陽性/陰性參考品符合率

陽性參考品的檢測旨在驗證試劑盒檢測范圍內(nèi)的MRSA/SA均可以在適當?shù)臐舛缺粰z測到，陽性參考品檢測結(jié)果應為陽性。陰性參考品旨在評價試劑特異性，陰性參考品檢測結(jié)果應為陰性。

7.方法學比對研究

為驗證擬申報產(chǎn)品靶核酸檢測的準確性，應選擇部分臨床樣本將擬申報產(chǎn)品與已上市核酸檢測試劑進行比較研究。所選對比試劑檢測靶基因應與擬申報試劑一致，方法性能可比，且臨床公認質(zhì)量較好；對于無已上市核酸檢測試劑的目的基因，可與病毒核酸序列測定方法進行比對。用于核酸序列測定的引物序列應不同于考核試劑中用于檢測目的基因的引物序列。建議對擴增子進行雙向測序。方法學比對研究的具體方式可參考相關的國外或國內(nèi)有關的指導文件進行，臨床樣本數(shù)量及其特性應具有代表性，能夠充分驗證擬申報產(chǎn)品靶核酸檢測的準確性。

8.其他性能研究（如涉及）

如攜帶污染的驗證，使用高陽性樣本和陰性樣本交叉檢測多次運行，考察設備多樣本檢驗是否存在攜帶污染。

（五）陽性判斷值確定資料

對于此類試劑，陽性判斷值即為針對每個目標物能夠獲得理想的臨床靈敏度和臨床特異性的臨界值（Cutoff），對于熒光探針PCR方法即為Ct值的確定資料。建議采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進行相關研究。申請人應選取適當?shù)淖銐驍?shù)量的臨床樣本進行試驗以確定陽性判斷值。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

樣本穩(wěn)定性進行研究，可以在合理的溫度范圍內(nèi)，每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。冷凍保存的樣本還應對凍融次數(shù)進行評價。

對于樣本提取后不能立即進行檢測的，應明確核酸儲存條件、儲存時間等內(nèi)容，同時應提供相應的核酸穩(wěn)定性研究資料。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（七）產(chǎn)品風險分析資料

申請人應參考YY/T 0316《醫(yī)療器械 風險管理對醫(yī)療器械的應用》規(guī)定的過程和方法，在產(chǎn)品生命周期內(nèi)對申報產(chǎn)品可能造成的危害進行判定（可重點參考YY/T 0316的附錄H），對每一危害處境的風險進行判定和評價，形成風險管理報告，控制這些風險并監(jiān)視控制的有效性，充分保證產(chǎn)品的安全性和有效性。

該試劑的主要危害大致可包括三個方面，即：生物學和化學危害、操作危害、信息危害。

1.生物學和化學危害

生物學：如細菌、病毒引起的交叉感染、檢測完成后剩余樣本、試劑和廢棄物處理不當引起的交叉感染。

化學：如使用的清潔劑、消毒劑殘留引發(fā)的危害。

2.操作危害

不正確的測量：

如未按使用說明書中的要求進行測量，造成的測量失敗、測量誤差過大。

使用未經(jīng)驗證的不同廠家的分析儀或使用未經(jīng)正確保養(yǎng)或校準的儀器，造成的測量失敗、測量誤差過大。

在制造商規(guī)定的使用環(huán)境條件外使用產(chǎn)品，可能造成測量誤差過大。

3.信息危害

如說明書或標簽缺少或不正確，標記的位置不正確，不能被正確的識別，不能清楚易認。

不符合法規(guī)及標準規(guī)定的產(chǎn)品說明書，包括產(chǎn)品說明書中未對限制充分告知，未對不正確的操作、與其他設備共同使用時易產(chǎn)生的危害進行警告，未正確標示儲存條件、消毒方法、維護信息，未對因長期使用產(chǎn)生功能喪失而可能引發(fā)的危害進行警告，未對合理可預見的誤用進行警告等引發(fā)的危害。

（八）臨床評價資料

臨床試驗的開展、方案的制定以及報告的撰寫等均應符合相關法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第16號）的要求。

1.研究方法

建議采用前瞻性臨床試驗對擬申報產(chǎn)品進行臨床評價，以SA和MRSA鑒定和藥敏檢測臨床參考方法作為對照方法，金黃色葡萄球菌鑒定應結(jié)合形態(tài)學、凝固酶試驗和生化鑒定、質(zhì)譜方法等方法，藥敏方法建議使用頭孢西丁紙片法或苯唑西林微量肉湯/瓊脂稀釋法（MIC），也可以應用相應的全自動鑒定藥敏方法，證明擬上市產(chǎn)品的臨床性能和預期用途。針對不同樣本類型對應的不同預期用途，分別設計臨床試驗進行研究。

2.臨床試驗病例數(shù)

臨床試驗樣本量應滿足統(tǒng)計學要求，可采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法進行估算。本臨床試驗的主要評價指標為擬申報產(chǎn)品相對于臨床參考方法的靈敏度和特異性。

臨床總體樣本量應分別考慮SA和MRSA陽性和陰性樣本量的統(tǒng)計需求，綜合估算。SA和MRSA的臨床試驗陽性樣本例數(shù)的估算建議采用單組目標值法，考核試劑的SA鑒定和MRSA藥敏檢測靈敏度目標值建議針對不同樣本類型設置，建議鼻拭子、痰液、皮膚軟組織拭子等直接樣本的目標值不低于90%，血培養(yǎng)樣本目標值不低于95%。通過參數(shù)估計（含相應可信區(qū)間估計）的方法證明產(chǎn)品針對SA鑒定和MRSA藥敏檢測的靈敏度不低于目標值，可參考如下樣本量公式計算。

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為標準正態(tài)分布的分數(shù)位，P0為評價指標的目標值，PT為試驗用體外診斷試劑評價指標預期值。

SA和MRSA的陰性樣本量的估算可不采用目標值法，建議根據(jù)預實驗獲得的特異度的預期值采用如下公式計算：

公式中n為樣本量，Z1-α/2為標準正態(tài)分布的分位數(shù)，P為評價指標預期值，Δ為P的允許誤差大小，一般取P的95%可信區(qū)間寬度的一半，常用的取值為0.05-0.1。

同時總體樣本確定時應考慮到培養(yǎng)鑒定的成功率、其他可能造成樣本脫落的情況以及可能需要納入的干擾等適當增加樣本量。如不同樣本類型適用不同預期用途，針對每一種預期用途臨床試驗總病例數(shù)均應分別滿足統(tǒng)計學要求。

3.臨床研究單位的選擇

應選擇不少于3家（含3家）臨床試驗機構(gòu)，按照相關法規(guī)、指導原則的要求開展臨床試驗。臨床試驗機構(gòu)的選擇應盡量考慮擬申報產(chǎn)品的特點和預期用途，綜合流行病學背景，鑒于不同地區(qū)及醫(yī)療機構(gòu)中SA/MRSA流行情況的差異，應選擇不同地區(qū)的臨床試驗機構(gòu)開展臨床試驗，不得選擇同一地區(qū)地域相近的醫(yī)療機構(gòu)進行臨床試驗。且臨床試驗機構(gòu)應具有分子生物學方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)，熟悉評價方案。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗病例選擇應根據(jù)產(chǎn)品聲稱預期用途中使用的樣本類型及適用人群進行選擇，如臨床背景內(nèi)容中所述，該產(chǎn)品適用不同樣本類型時對應不同的臨床預期用途，采用鼻拭子樣本的試劑用于MRSA院內(nèi)感染的預防和控制時，應采用醫(yī)療機構(gòu)中的住院病人包括重癥監(jiān)護病人、手術病人及長期護理病人等病例進行臨床研究；皮膚及軟組織感染拭子用于結(jié)合其他實驗室檢測如微生物培養(yǎng)等輔助診斷MRSA/SA的皮膚和軟組織感染時，應采用臨床皮膚和軟組織感染病例進行臨床研究；血培養(yǎng)測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產(chǎn)生的革陽性球菌（GPC）的樣本用于臨床需進行血培養(yǎng)檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷時，應采用臨床需進行血培養(yǎng)檢測的患者，且血培養(yǎng)測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產(chǎn)生的革蘭陽性球菌的患者作為病例進行臨床研究。同時適用于上述不同樣本類型時，應分別進行相關病例的臨床研究。

申請人在建立病例納入標準時，應綜合考慮到試劑所適用的各類人群的潛在差異，如年齡、性別、病情等。

同時應關注樣本中其他病原體的存在情況、內(nèi)源和外源干擾因素。

5.倫理學要求

臨床試驗必須符合赫爾辛基宣言的倫理學準則，必須獲得臨床試驗機構(gòu)倫理委員會的同意。研究者應考慮臨床試驗用樣本的獲得和試驗結(jié)果對受試者的風險性，應提交倫理委員會的審查意見。

6.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應從流行病學、統(tǒng)計學、臨床醫(yī)學、檢驗醫(yī)學等多方面考慮，設計科學合理的臨床研究方案。各臨床研究機構(gòu)的方案設置應基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應在臨床研究機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術人員操作完成，申報單位的技術人員除進行必要的技術指導外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑應一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。

7.統(tǒng)計學分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、臨床靈敏度、特異度等。常選擇2×2表的形式總結(jié)兩種方法的定性檢測結(jié)果。在臨床研究方案中應明確統(tǒng)計檢驗假設，即評價考核試劑與參比方法是否等效的標準。靈敏度結(jié)果的95%置信區(qū)間下限應高于目標值。特異性結(jié)果與預期值差異應有明確可接受標準，如差異較大，應有合理的解釋或繼續(xù)擴大樣本量。應分別對SA和MRSA的檢測結(jié)果進行比較統(tǒng)計和分析。

對于不一致樣本，應在方案中明確是否需進一步復測或確認，并對不一致原因進行分析。

8.質(zhì)量控制

臨床試驗開始前，建議進行臨床試驗的預試驗，以熟悉并掌握相關試驗方法的操作、儀器、技術性能等，最大限度控制試驗誤差。整個試驗過程都應處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可精密度精密度。

9.臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的要求，臨床試驗報告應該對試驗的整體設計及各個關鍵點給予清晰、完整的闡述，應該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應包括必要的基礎數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進行詳述。

9.1臨床試驗總體設計及方案描述

9.1.1臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

9.1.2病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預期選擇例數(shù)及標準、盲態(tài)檢測要求等。

9.1.3樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

9.1.4統(tǒng)計學方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準。

9.2 具體的臨床試驗情況

9.2.1臨床試驗所用體外診斷試劑及儀器的名稱、批號、機型等信息。

9.2.2對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況分布情況進行綜合，建議以列表或圖示方式列出各年齡組的樣本例數(shù)。

9.2.3質(zhì)量控制，試驗人員培訓、儀器日常維護、儀器校準、質(zhì)控品運行情況。

9.2.4具體試驗過程，樣本收集、樣本保存、樣本檢測、結(jié)果處理、結(jié)果不一致樣本的確認等。

9.3統(tǒng)計學分析

9.3.1數(shù)據(jù)預處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改；

9.3.2結(jié)果的一致性分析

計算陽性符合率、陰性符合率、總體符合率，采用適當?shù)慕y(tǒng)計學方法，如四格表卡方檢驗或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

9.4討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

9.5其他

臨床試驗中如涉及核酸序列測定方法，應在臨床研究報告中對選用的測序方法做詳細介紹，并提供以下關于測序試驗的詳細信息及資料。

9.5.1測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關信息。

9.5.2測序方法所用引物相關信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性試驗等資料。

9.5.3對所選測序方法的分析性能進行合理驗證，尤其是最低檢測限的確認，建議將所選測序方法與擬申報產(chǎn)品的相關性能進行適當比對分析。

9.5.4測序方法應建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對臨床樣本的檢測結(jié)果進行質(zhì)量控制。

9.5.5提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。

（九）產(chǎn)品技術要求

申請人應當在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、前期臨床評價等結(jié)果，依據(jù)國家標準、行業(yè)標準及有關文獻，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術要求編寫指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第9號）的有關要求，編寫產(chǎn)品技術要求。

該試劑的產(chǎn)品性能指標應主要包括：物理性狀、陰/陽性參考品符合率、精密度、最低檢測限等。性能指標應依據(jù)分析性能評估試驗結(jié)果確定，檢驗方法應明確具體操作方法和使用的樣本及參考品情況。

該產(chǎn)品為第三類體外診斷試劑，申請人應按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術要求編寫指導原則》的要求，以附錄形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品要求，附錄的編制應符合相關編寫規(guī)范的要求。

（十）產(chǎn)品檢驗報告

應提供該產(chǎn)品符合產(chǎn)品技術要求的，在具有相應醫(yī)療器械檢驗資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行的產(chǎn)品檢驗報告；應提供連續(xù)3個生產(chǎn)批次樣品的檢驗合格報告。

（十一）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預期用途、標本采集及處理、檢驗方法、檢驗結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應符合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告2014年第17號）的要求，進口體外診斷試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習慣。產(chǎn)品說明書中相關技術內(nèi)容均應與申請人提交的注冊申報資料中的相關研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨列明文獻的相關信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》的要求，下面對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌鑒別和檢測的體外診斷試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明，以指導注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預期用途】

1.1試劑盒用于定性檢測人鼻拭子、痰液、皮膚及軟組織感染拭子、血培養(yǎng)測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產(chǎn)生的革蘭陽性球菌的樣品等樣本的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和金黃色葡萄球菌，適用樣本類型應結(jié)合實際的臨床研究完成情況進行確認。

1.2明確試劑不同樣本類型的臨床意義，如鼻拭子樣本用于醫(yī)療機構(gòu)對住院病人包括重癥監(jiān)護病人、手術病人及長期護理病人等MRSA院內(nèi)感染的預防和控制；皮膚及軟組織感染拭子用于結(jié)合其他實驗室檢測如微生物培養(yǎng)等輔助診斷MRSA/SA的皮膚和軟組織感染；血培養(yǎng)測定為陽性微生物生長并顯示包含由革蘭染色法產(chǎn)生的革蘭陽性球菌的樣本用于臨床需進行血培養(yǎng)檢測的患者MRSA/SA感染的輔助診斷等。

1.3SA和MRSA流行特征介紹。

1.4簡單介紹待測目標的特征，如待測靶基因特征及與SA和MRSA的關系等。

2.【檢驗原理】

詳細說明試劑盒技術原理，即核酸分離/純化方法、原理。說明檢測的靶基因座位、序列長度等；介紹引物及探針設計、不同樣品反應體系（管）組合、對照品（質(zhì)控品）設置及熒光信號標記等。如添加了相關的防污染組分（如尿嘧啶DNA糖基化酶，即UDG/UNG等），也應對其作用機理作適當介紹。

3.【主要組成成分】

詳細說明試劑盒內(nèi)各組分的名稱、數(shù)量、成分、濃度等信息，如含有生物源性物質(zhì)，應說明其生物學來源、活性及其他特性；說明不同批號試劑盒中各組分是否可以互換。

試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組分，應列出相關試劑的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱、貨號以及醫(yī)療器械注冊證號/備案號（如有）等詳細信息。當試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分時，應在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的如上信息。

4.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、復溶穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等，應與相應的穩(wěn)定性研究結(jié)論一致。

5.【適用儀器】

所有適用的儀器型號，提供與儀器有關的重要信息以指導用戶操作。

6.【樣本要求】 

明確適用的樣本類型。并詳細描述樣本采集及預處理要求、運輸要求、保存條件及期限等。特別是樣本采集所需設備及保存液，需特別明確供應商、貨號及注冊證號（如有）。有關描述均應建立在相關性能評價及穩(wěn)定性研究的基礎上。

樣本的取材及處理方式等若有通用的技術規(guī)范或指南，則應遵循，并在此處引用。

7.【檢驗方法】

詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

7.1試劑配制方法、注意事項。

7.2核酸分離/純化的條件、步驟及注意事項。對照品（質(zhì)控品）參與樣本核酸的平行提取的要求等。

7.3擴增反應前準備：各組分加樣體積、順序、相關注意事項等。

7.4 PCR各階段的溫度、時間設置、循環(huán)數(shù)設置及相關注意事項。

7.5儀器設置：特殊參數(shù)，待測基因、內(nèi)標的熒光通道選擇等。

7.6質(zhì)量控制：說明對照品（質(zhì)控品）的檢測要求。

8.【陽性判斷值】

簡要總結(jié)陽性判斷值研究方法及結(jié)論。明確說明樣本的陽性判斷值。

9.【檢驗結(jié)果的解釋】

說明對照品、內(nèi)標的正確結(jié)果要求，結(jié)合對照品（質(zhì)控品）以及樣本管中靶基因和內(nèi)標的檢測結(jié)果，對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應的解釋進行詳述。檢驗結(jié)果的解釋應以陽性判斷值的研究結(jié)論為依據(jù)。

10.【檢驗方法的局限性】

應至少包括如下描述：

10.1本試劑檢測結(jié)果應結(jié)合患者臨床癥狀及其他相關醫(yī)學檢查結(jié)果進行綜合分析，不得單獨作為患者管理的依據(jù)。

10.2基因檢測結(jié)果僅能覆蓋耐藥機制為相應基因（如mecA基因和或mecC）的耐藥結(jié)果，但是小部分MRSA不攜帶mecA和/或mecC基因，存在其它耐藥機制，可能出現(xiàn)漏檢。

10.3不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理以及不當?shù)膶嶒灢僮骱蛯嶒灜h(huán)境均有可能導致假陰性或假陽性結(jié)果。

11.【產(chǎn)品性能指標】

詳述分析性能評估的試驗結(jié)果并簡要描述臨床試驗的基本信息、試驗方法和結(jié)論。

12.【注意事項】

應至少包括以下內(nèi)容：

12.1如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應給出生物安全性的警告。

12.2臨床實驗室應嚴格按照《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增實驗室管理辦法》（衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194號或現(xiàn)行有效版本）等有關分子生物學實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。

12.3強調(diào)產(chǎn)品性能僅針對聲稱的適用樣本類型及【樣本要求】項下說明的樣本采集和處理方法（包括樣本采集液等）進行了驗證，其他樣本類型或樣本采集、處理方法不能保證產(chǎn)品性能。

12.4強調(diào)實驗操作人員應接受過基因擴增或分子生物學方法檢測的專業(yè)培訓，具備相關的實驗操作資格，實驗室應具備合理的生物安全防備設施及防護程序。

四、編寫單位

國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術審評中心。