附件：重組人源化膠原蛋白原材料評價指導(dǎo)原則（2023年第16號）.doc

重組人源化膠原蛋白原材料評價指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對醫(yī)療器械所用重組人源化膠原蛋白原材料進行充分的研究，并整理形成產(chǎn)品注冊申報資料，同時也為技術(shù)審評部門對重組人源化膠原蛋白制成的產(chǎn)品注冊申報資料包括所引用主文檔相關(guān)內(nèi)容的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則系對醫(yī)療器械用重組人源化膠原蛋白原材料的一般要求，適用于人膠原蛋白的所有型別，注冊申請人需依據(jù)具體醫(yī)療器械產(chǎn)品的特性對產(chǎn)品注冊申報資料涉及的原材料相關(guān)內(nèi)容進行充實和細化，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容的適用性。本指導(dǎo)原則不直接涉及重組人源化膠原蛋白原材料制成的醫(yī)療器械終產(chǎn)品的安全性或有效性評價，具體產(chǎn)品的評價請參考相應(yīng)的產(chǎn)品注冊審查指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是對注冊申請人和技術(shù)審評人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料；需在遵循相關(guān)法規(guī)和強制性標(biāo)準(zhǔn)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。

一、前言

近年來，隨著基因重組、蛋白質(zhì)組學(xué)等基礎(chǔ)理論、技術(shù)手段和臨床醫(yī)療探索研究的不斷發(fā)展，重組膠原蛋白日益成為重要的生物材料，為相關(guān)醫(yī)療器械的研發(fā)提供了新的思路與方法。重組人源化膠原蛋白是由DNA重組技術(shù)制備的人膠原蛋白特定型別基因編碼的全長或部分氨基酸序列片段，或是含人膠原蛋白功能片段的組合。

重組人源化膠原蛋白僅是重組膠原蛋白的一類，材料特性并不能完全決定最終產(chǎn)品的安全性和有效性。本指導(dǎo)原則中的“原材料”是指用于生產(chǎn)制造醫(yī)療器械用的重組人源化膠原蛋白材料。除特別說明外，本指導(dǎo)原則中的“材料”等同于“原材料”。

重組人源化膠原蛋白是通過基因工程生產(chǎn)的蛋白，工程細胞構(gòu)建過程、生產(chǎn)用細胞的質(zhì)量控制及常規(guī)生產(chǎn)過程控制是該原材料生產(chǎn)工藝及風(fēng)險評價的基礎(chǔ)，此方面主要的驗證資料，可參考本指導(dǎo)原則的資料性附件作為原材料研究資料的補充，但不作為產(chǎn)品注冊申報資料的必要內(nèi)容。結(jié)合重組人源化膠原蛋白的特點，該資料性附件修改引用了國家藥監(jiān)局藥審中心《重組制品生產(chǎn)用哺乳動物細胞質(zhì)量控制技術(shù)評價一般原則》《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》等生物制品指導(dǎo)原則的相關(guān)內(nèi)容。

二、評價要點

（一）   重組人源化膠原蛋白原材料性能研究

為了確保重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量可控，重組人源化膠原蛋白需參考相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行必要的鑒別、純度和雜質(zhì)等分析，可采用不同的分析方法對原材料的分子量、等電點、氨基酸序列、各種翻譯后修飾（如脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾、脯氨酸羥基化等）進行充分鑒定，并進行相應(yīng)的檢測，以確認終產(chǎn)物具有擬宣稱的原材料構(gòu)象、聚集狀態(tài)、降解狀態(tài)及膠原蛋白高級結(jié)構(gòu)。

材料理化特性分析需按照醫(yī)療器械制備工藝和特點，結(jié)合其風(fēng)險控制要求進行相關(guān)研究，建議對如下常規(guī)理化項目進行研究，例如氨基酸序列、蛋白空間結(jié)構(gòu)、劑型（如溶液、凍干粉、凝膠、纖維、海綿等）、膠原蛋白型別等特異性性能，同時結(jié)合醫(yī)療器械特點，完善理化性能指標(biāo)要求。

需根據(jù)不同的預(yù)期用途及使用部位、不同生產(chǎn)工藝、預(yù)期使用效果和最終醫(yī)療器械的狀態(tài)，選擇適用的指標(biāo)；根據(jù)膠原蛋白原材料是否經(jīng)過交聯(lián)或化學(xué)修飾，宜提供交聯(lián)劑或修飾劑的殘留量、降解性能等的研究，提供相應(yīng)的研究報告。

性能指標(biāo)的建立及驗證取決于膠原蛋白原材料性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗等多種因素。新的分析技術(shù)及對現(xiàn)有技術(shù)的改進正在不斷進行，適當(dāng)時需使用這些新的技術(shù)。因現(xiàn)有技術(shù)原因而產(chǎn)生偏差的需進行合理性解釋說明。

1.鑒別

1.1氨基酸序列及覆蓋度

首先需明確氨基酸序列的選擇依據(jù)，如為特定氨基酸序列片段組成的，還需明確片段重復(fù)次數(shù)及依據(jù)。需采用綜合的方法測定目標(biāo)膠原蛋白原材料的氨基酸序列，并與其基因序列對應(yīng)的理論氨基酸序列進行比較驗證。肽段覆蓋率的檢測結(jié)果需為100%覆蓋，末端氨基酸序列檢測結(jié)果需與理論序列完全一致?？砂凑铡吨亟M人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，直接使用供試品檢測，并選擇適宜的酶解條件進行水解，酶解后選擇不小于5個連續(xù)氨基酸的片段為基本的序列單元進行覆蓋分析。

如適用，目標(biāo)膠原蛋白材料的理論氨基酸序列需包括二硫鍵連接方式。氨基酸序列測定還需考慮可能存在的N端甲硫氨酸（如大腸桿菌來源的膠原蛋白原材料），信號肽或前導(dǎo)序列。

1.1.1氨基酸組成

使用各種水解法和分析手段測定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸組成或天然異構(gòu)體比較。如需要時需考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對肽段和小蛋白可提供有價值的結(jié)構(gòu)資料，但對大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。

1.1.2氨基酸末端序列

氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。用氨基酸序列分析儀或質(zhì)譜法測定N端和/或C端氨基酸序列，其結(jié)果需符合理論預(yù)測。

若發(fā)現(xiàn)目的膠原蛋白材料的末端氨基酸發(fā)生改變時，需使用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應(yīng)變異數(shù)量。需將這些氨基酸末端序列與來自目的膠原蛋白基因序列推導(dǎo)的氨基酸末端序列進行比較。

1.2肽圖

按照《中華人民共和國藥典》 四部 通則 肽圖檢查法 第一法 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法進行測定，建立膠原蛋白原材料標(biāo)準(zhǔn)肽圖。

推薦利用四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀（Q-TOF MS）建立標(biāo)準(zhǔn)肽圖，作為膠原蛋白材料的指紋圖譜，用于材料的批間一致性和穩(wěn)定性評價，以及材料特異性的鑒別。

需用合適的酶或化學(xué)試劑使所選的材料片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應(yīng)用高效液相色譜法（HPLC）或其他適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠?。盡量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)，N-末端測序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。至少對材料成品放行來說,經(jīng)驗證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的材料結(jié)構(gòu)/鑒別的適當(dāng)方法。具體分析方法可參考《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3分子量

對申報醫(yī)療器械所用膠原蛋白材料可參照《中華人民共和國藥典》高效液相色譜法、“電泳法”的“第五法  SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法”、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜方法建立分子量及分布檢測方法，也可以運用其他適當(dāng)技術(shù)測定分子量，如分子排阻色譜法等。需通過至少一種合理的、經(jīng)驗證的方法證明其實際分子量與理論預(yù)測一致。

高效液相色譜法目標(biāo)蛋白的出峰保留時間需與參比品一致；高分辨質(zhì)譜法分子量需與參比品一致；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分子量電泳條帶位置需與參比品一致。同時，需就參比品的選擇提供合理性依據(jù)。

1.4等電點

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 電泳法第六法（等電聚焦電泳法）或0542毛細管電泳法進行檢測，等電點需在標(biāo)示范圍內(nèi)，也可以運用其他適當(dāng)?shù)姆椒y定。

1.5巰基和二硫鍵

如果目的膠原蛋白材料的基因序列存在半胱氨酸殘基時，需盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測定法或其他適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

1.6消光系數(shù)（或克分子吸光度）

多數(shù)情況下，可取目的膠原蛋白材料于UV/可見光波長處測定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測定為使用UV/可見光或分光光度計檢測已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應(yīng)用氨基酸組成分析技術(shù)或定氮法等方法測定。

1.7電泳圖型

應(yīng)用PAGE電泳、等電聚焦、SDS－PAGE電泳、免疫印跡、毛細管電泳法或其他適當(dāng)?shù)姆椒?獲得目的膠原蛋白材料的一致性，同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。

1.8液相色譜圖譜

應(yīng)用分子篩色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和色譜或其他適當(dāng)方法，獲得目的膠原蛋白材料的一致性、同一性和純度的色譜圖譜和數(shù)據(jù)。

2.結(jié)構(gòu)表征

2.1脯氨酸羥基化

若在設(shè)計時進行脯氨酸羥基化，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求進行分析，并規(guī)定標(biāo)示值。

2.2高級結(jié)構(gòu)分析

鑒于高級結(jié)構(gòu)與重組人源化膠原蛋白表現(xiàn)出的性能和功能密切相關(guān)，若材料擬宣稱具有相應(yīng)的高級結(jié)構(gòu)，采用多種方法對高級結(jié)構(gòu)進行研究分析，包括以下列舉的方法及其他結(jié)構(gòu)表征方法，如冷凍電鏡、蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)等方法。

2.2.1三螺旋結(jié)構(gòu)分析

可采用圓二色譜在特定常規(guī)試驗條件下的檢測重組人源化膠原蛋白的CD光譜特征。若采用特定的非常規(guī)條件檢測，則檢測結(jié)果僅反映膠原蛋白材料在該條件下可（否）具有形成類似膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的CD光譜特征能力；此時需分析并闡述所檢測樣品是否代表“原材料樣品”，還是“原材料樣品”的特定處理（后續(xù)加工）樣品。同時建議進行最低檢出限分析，其結(jié)果需與生理性膠原蛋白相近（相差不超過一個數(shù)量級）?？刹捎肵射線晶體學(xué)技術(shù)或冷凍電鏡技術(shù)在原子結(jié)構(gòu)水平考證膠原蛋白材料或其包含的特定氨基酸序列的三螺旋結(jié)構(gòu)特性，計算有結(jié)構(gòu)信息的序列占整個蛋白序列的百分比；可采用差示掃描量熱法檢測膠原蛋白材料結(jié)構(gòu)變化的熱效應(yīng)輔助說明膠原蛋白的高級結(jié)構(gòu)特征；可采用紅外光譜進行結(jié)構(gòu)分析，其非特征區(qū)（如：酰胺a、b）和特征區(qū)（如：酰胺I、酰胺II、酰胺III）的特征峰位置需與參比品一致；可采用拉曼光譜，其拉曼光譜圖需與參比品一致；也可應(yīng)用其它紫外或可見光吸收光譜法、核磁共振（NMR）等適當(dāng)?shù)姆椒z測。

2.2.2纖維質(zhì)量/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表征

若材料預(yù)期形成纖維/網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時，宜使用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）或原子力顯微鏡（AFM）等方法觀察膠原蛋白材料形成膠原纖維束/多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等，需明確兩種方法具體的制樣和觀察測定過程。與此相關(guān)的膠原分子自組裝和聚合能力分析，可參考相關(guān)國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行研究。

3.純度

關(guān)于純度的要求可根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品的用途和用法而確定。存在二硫鍵時重組人源化膠原蛋白可能會形成寡聚體，且其電泳分子量大小需成倍增加，寡聚體需視為重組人源化膠原蛋白而非雜質(zhì)。

4.含量

需建立重組人源化膠原蛋白含量檢測方法，含量以質(zhì)量/重量或質(zhì)量/體積表示。含量檢測可通過液相色譜法（HPLC）、凱氏定氮法、特征多肽法等。

5.雜質(zhì)、污染物和添加劑

對膠原蛋白材料工藝相關(guān)雜質(zhì)以及外源污染物等進行研究，如：細胞基質(zhì)來源、細胞培養(yǎng)來源和下游工藝。需對潛在的工藝相關(guān)雜質(zhì)（如宿主細胞蛋白質(zhì)、宿主細胞DNA、細胞培養(yǎng)殘留物、下游工藝的殘留物等）進行鑒別、評估，并進行定性和/或定量分析，并采用適宜的方法評價其對生物學(xué)功能的影響。工藝相關(guān)雜質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來源于細胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。細菌內(nèi)毒素、微生物限度和無菌性，是常規(guī)的污染物控制要求。

5.1源于細胞基質(zhì)的雜質(zhì)

來源于細胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對于宿主細胞蛋白，一般需用能檢測出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測方法。需用不含目的基因的生物體粗提物，即不含膠原蛋白編碼基因的生產(chǎn)用細胞，制備上述試驗使用的多克隆抗體?？赏ㄟ^對膠原蛋白材料的直接分析方法（如雜交技術(shù)法）檢測宿主細胞的DNA水平，和/或通過標(biāo)記試驗（實驗室規(guī)模）檢測證實通過純化工藝能去除核酸。對于有意導(dǎo)入的病毒，需驗證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。

5.1.1外源性DNA殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“外源性DNA殘留量測定法”的“熒光染色法”或“定量PCR法”進行測定，“熒光染色法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足70%～130%；“定量PCR法”的樣品加標(biāo)回收率需滿足50%～150%，需規(guī)定殘留限量。如果樣品中外源性DNA殘留量低于“熒光染色法”的檢測限，則需采用“定量PCR法”進行測定。

需根據(jù)醫(yī)療器械產(chǎn)品的預(yù)期臨床用途、使用量等，確定含重組人源化膠原蛋白的材料臨床最大使用量的外源性DNA殘留量限值。推薦參考生物制品外源性DNA殘留限量要求，結(jié)合殘留DNA宿主類型及其風(fēng)險程度設(shè)定每人每次最大使用量限值。

建議參考生物制品中大腸桿菌或酵母菌表達的基因工程重組生物制品的外源性DNA殘留量限度。

5.1.2宿主細胞蛋白質(zhì)殘留量

5.1.2.1大腸桿菌蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“大腸埃希菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法”或采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定。

5.1.2.2酵母蛋白質(zhì)殘留量

按照《中華人民共和國藥典》“酵母工程菌菌體蛋白質(zhì)殘留量測定法”或采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定。

5.1.2.3CHO細胞蛋白質(zhì)殘留量

采用經(jīng)驗證的酶聯(lián)免疫試劑盒進行測定。

5.1.3促炎性污染物（肽聚糖）

采用經(jīng)驗證的方法或經(jīng)驗證的市售細菌肽聚糖檢測試劑盒（ELISA）檢測殘留肽聚糖，需根據(jù)其致熱反應(yīng)風(fēng)險規(guī)定可接受的限量要求。

5.1.4碳水化合物結(jié)構(gòu)

根據(jù)細胞基質(zhì)等因素，必要時需考慮測定糖蛋白中碳水化合物的含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外，盡可能分析碳水化合物的結(jié)構(gòu)、寡糖形態(tài)（長鏈狀）和多肽的糖基化位點。

5.2源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)

來源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導(dǎo)劑（多核苷酸，病毒）、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。需根據(jù)工藝中采用的表達體系和使用的抗生素類型，采用經(jīng)驗證的方法測定殘余抗生素含量/活性，殘余抗生素含量需符合《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，不應(yīng)有殘余抗生素活性。

殘余抗生素含量的測定按照YY/T 1849《重組膠原蛋白》中描述的方法或其他經(jīng)驗證的方法進行檢測，殘余抗生素活性按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 生物活性測定法中抗生素微生物檢定法或《中華人民共和國藥典》 四部通則 抗生素殘留量檢查法進行檢測。

5.3源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)

來源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)一般包括酶、化學(xué)/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無機鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質(zhì)。需結(jié)合實際情況制定相關(guān)理化指標(biāo)。

5.3.1添加劑

如果使用了防腐劑、凍干保護劑等添加劑，需給出其限量要求和檢測方法。

5.3.2重金屬及微量元素含量需符合以下規(guī)定。

5.3.2.1重金屬元素

對工藝中添加的重金屬元素，需符合規(guī)定限值。

5.3.2.2重金屬含量

重金屬總量（以Pb計）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的限值。

5.3.2.3微量元素含量

微量元素含量：砷（As）、汞（Hg）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu）、鉬（Mo）、鐵（Fe）、鎳（Ni）需符合YY/T 1888《重組人源化膠原蛋白》等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中的要求。

5.4細菌內(nèi)毒素

細菌內(nèi)毒素相關(guān)限量要求需考慮醫(yī)療器械終產(chǎn)品與人體的接觸方式。

5.5微生物限度

若重組人源化膠原蛋白材料以微生物限度控制狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法進行檢測，結(jié)果需符合相關(guān)要求。

5.6無菌

若重組人源化膠原蛋白材料以無菌狀態(tài)提供，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 無菌檢查法進行檢測，結(jié)果需無菌。

5.7分子變異體

需對重組人源化膠原蛋白材料的各種分子變異體進行分離、鑒別和分析。如變異體的功能與目標(biāo)產(chǎn)物一致時可不做雜質(zhì)考慮。需考慮在生產(chǎn)和/或貯存期間膠原蛋白材料降解產(chǎn)物是否顯著增加及其與免疫原性的相關(guān)性。以下為最常見的目的膠原蛋白材料的分子變異體，并列出了相應(yīng)的檢測方法。

5.7.1化學(xué)修飾類型

各種非預(yù)期的翻譯后修飾是導(dǎo)致重組蛋白異質(zhì)性的重要質(zhì)量問題，如：脫酰胺化、氧化、糖譜/糖基化修飾等和其他可能的N端、C端修飾（如乙?；?、酰胺化或者由于外肽酶導(dǎo)致的部分降解以及C端加工、N端焦谷氨酸等），以及各種其他異質(zhì)性（如異構(gòu)化、碎片化、二硫鍵錯配、N-連接和O-連接的寡糖、聚集等）。適用時，需按YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的要求，參照《重組膠原蛋白肽圖指紋圖譜分析》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行分析。需考慮脫酰胺、異構(gòu)化、錯配二硫鍵連接和氧化形式的分離和鑒別。對這些變異體的分離和鑒別，可采用層析法、電泳法（如毛細管電泳）、質(zhì)譜法和/或光譜法（如圓二色譜）。需注意在修飾不會引起或只引起較小的分子量變化及結(jié)構(gòu)變化的情況下，這些方法可能無法鑒別。此時，需要結(jié)合功能性試驗，評價所發(fā)生的修飾是否影響預(yù)期的功能和使用。

5.7.2降解物和聚合體

降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體，可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進行定量；需建立成品中非預(yù)期降解物的判定標(biāo)準(zhǔn)，并對穩(wěn)定性試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進行監(jiān)測。

6.熱穩(wěn)定性

如果重組人源化膠原蛋白是多聚體，可采用差示掃描量熱分析（DSC）進行解聚溫度分析?？蓞⒖肌吨腥A人民共和國藥典》 四部。

如果是單鏈的蛋白肽，可參考《中華人民共和國藥典》 四部，人免疫球蛋白3.3.2.4熱穩(wěn)定性試驗，將供試品置（57±0.5）℃水浴中保溫4h后，用可見異物檢查裝置，肉眼觀察需無凝膠化或絮狀物。

7.其它理化指標(biāo)

膠原蛋白材料其它性能指標(biāo)宜根據(jù)醫(yī)療器械終產(chǎn)品特性及相關(guān)通用要求制定，在適用時，需對相關(guān)性能指標(biāo)檢測方法使用的參比品進行性能研究，對照品技術(shù)參數(shù)需明確且性能穩(wěn)定。用于理化測定等方面的參比品，需進行必要的分析鑒定，包括但不限于：

7.1外觀（如性狀、顏色）

用肉眼直接觀測，需為白色/淡黃色/無色透明液體或凝膠，或白色/類白色凍干粉或海綿狀固體。

注：隨著行業(yè)發(fā)展，可能存在其他外觀要求，需根據(jù)原材料具體形態(tài)規(guī)定外觀要求。

7.2可見異物

按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 可見異物檢查法第一法（燈檢法）進行檢測，需無明顯異物。

7.3溶解性

需根據(jù)供試品的溶解特性，對供試品在水、稀酸或中性鹽溶液中的溶解程度進行表征和闡述。

7.4水分

適用時（如凍干樣品），需明確水分含量。除另有規(guī)定外，取供試品約1g～2g，按照《中華人民共和國藥典》“水分測定法”第二法（烘干法）測定，或取供試品約10mg按照《中華人民共和國藥典》“熱分析法”熱重法（TG）測定，升溫程序：從室溫以10℃/min速率升溫至105℃，保持60min。減失重量需符合所標(biāo)示范圍。規(guī)定仲裁方法為水分測定法。

7.5熾灼殘渣

除另有規(guī)定外，取1.0-2.0g，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 熾灼殘渣檢查法進行檢測。

7.6酸堿度

液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL，按照《中華人民共和國藥典》 四部通則“pH值測定法”進行檢測，需符合所標(biāo)示值的±1.0。

7.7滲透壓摩爾濃度

適用時，液體和凝膠樣品直接取樣，固體樣品用生理鹽水稀釋為1mg/mL按照《中華人民共和國藥典》 四部通則 滲透壓摩爾濃度測定法進行檢測，滲透壓摩爾濃度范圍需符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

7.8動力黏度（凝膠）

取供試品按照《中華人民共和國藥典》“黏度測定法”的“旋轉(zhuǎn)黏度計測定法”測定，需要詳細描述試驗條件，動力黏度值需符合所標(biāo)示范圍。

7.9裝量及差異

根據(jù)供試品性狀（溶液、凝膠、凍干海綿或凍干粉末等）和裝量的不同確定裝量的允差要求。例如：20g（mL）以下，單個裝量不低于標(biāo)示裝量的93%；20g（mL）至50g（mL），單個裝量不低于標(biāo)示裝量的95%；50g（mL）以上，單個裝量不低于標(biāo)示裝量的97%；平均裝量不低于標(biāo)示裝量。

8.降解特性及產(chǎn)物

需對膠原蛋白材料降解特性進行研究，可采用凝膠滲透色譜（GPC）測定降解產(chǎn)物的分子量分布及分子量，水解/酶解產(chǎn)物可使用氨基酸分析儀、高效液相色譜或其他適宜的方法測定。

9.生物學(xué)功能評價

重組膠原蛋白的生物學(xué)功能是指以重組膠原蛋白生物學(xué)特性相關(guān)屬性為基礎(chǔ)的生物學(xué)作用，對聲稱的生物學(xué)功能宜進行定性定量分析。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，重組人源化膠原蛋白作為重組膠原蛋白的一種，其主要生物學(xué)功能也同樣是為細胞提供支架和良好的微環(huán)境，如促進細胞黏附、增殖、生長、分化等。因此，可通過評價細胞-膠原蛋白相互作用來評價重組人源化膠原蛋白的生物學(xué)功能。細胞增殖、分化、黏附性、遷移或移行評價方法可參考YY/T 1849《重組膠原蛋白》。

由于膠原類材料在分子組成、微結(jié)構(gòu)、物理性能方面可能差異顯著，需檢測材料與細胞之間相互作用及其引導(dǎo)細胞基礎(chǔ)響應(yīng)的性能。細胞響應(yīng)的參數(shù)包括細胞形態(tài)、面積和體積，均可通過二維（2D）或三維（3D）圖像技術(shù)可視化評價，還包括存活率、增殖率、程序化凋亡以及遷移。

鼓勵對重組人源化膠原蛋白對細胞的作用機理進行研究。例如，抗體阻斷試驗可用來確定細胞表面的何種受體參與了與膠原的作用，如整合素或盤狀結(jié)構(gòu)域受體（DDRs）。此外，細胞骨架成分（如肌動蛋白）的協(xié)同作用也可用來評價細胞與基質(zhì)間的粘附與收縮解離。有多種在單細胞或多細胞水平上評價細胞引導(dǎo)的收縮解離的方法，包括自由漂浮組織構(gòu)建物的尺寸隨時間的變化、施加在培養(yǎng)-力學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)上力的大小，以及單個細胞在膠原網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)力和形變等。

其它適用于干細胞和祖細胞類型的細胞-膠原相互作用的功能性檢測包括細胞株的定向分化，特定干細胞或祖細胞的增殖，或組織形態(tài)發(fā)生（始于內(nèi)皮祖細胞的血管形成）。按照《中華人民共和國藥典》 四部 進行成纖維細胞生長因子生物學(xué)活性測定，對膠原蛋白肽-細胞相互作用評價，反映膠原蛋白肽與成纖維細胞增殖的構(gòu)效關(guān)系。

按照《中華人民共和國藥典》 四部 生物活性測定法對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，包括對驗證指標(biāo)結(jié)果的繪圖和統(tǒng)計學(xué)分析，以及判斷其是否符合可接受標(biāo)準(zhǔn)等。常規(guī)的統(tǒng)計學(xué)方法一般要求數(shù)據(jù)之間相互獨立，并呈近似正態(tài)分布和方差齊性，通常采用相對效價的對數(shù)轉(zhuǎn)換值進行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)無法滿足上述統(tǒng)計學(xué)要求時，也可考慮采用其他適宜的替代方法進行數(shù)據(jù)分析。

上述關(guān)于膠原—細胞相互作用的功能性測定也可作為醫(yī)療器械產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的方法。三維支架材料中細胞活性評價方法可參考YY/T 1562《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 生物材料支架 細胞活性試驗指南》。

（二）   材料免疫學(xué)安全性研究

臨床前安全性評價包括臨床前安全性試驗，其目的主要是確定新膠原蛋白材料是否會在人體引起未能預(yù)料的不良反應(yīng)，免疫學(xué)安全性研究是重組人源化膠原蛋白材料生物安全性研究資料的主體。但是，用傳統(tǒng)生物試驗方法來評價重組人源化膠原蛋白往往有困難，并受多種因素的影響。例如高度的種屬特異性，人的蛋白質(zhì)對人的生物學(xué)活性遠高于對動物的活性，而且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列，常常與來自其它種系的蛋白質(zhì)不同，例如糖基。因而由基因工程技術(shù)所制備的蛋白質(zhì)或肽類往往會在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其生物學(xué)效應(yīng)有所改變，并可能因形成免疫復(fù)合物而導(dǎo)致有毒性反應(yīng)，而這樣產(chǎn)生的毒性反應(yīng)與人體安全性顯然無關(guān)。

另外，由于重組人源化膠原蛋白功能、生產(chǎn)工藝或者膠原蛋白材料穩(wěn)定性等要求，對膠原蛋白材料進行修飾或者改構(gòu)，需提供與未修飾或者改構(gòu)材料比較的研究資料。以簡化生產(chǎn)工藝為目的而引入的額外多肽片段如His-tag，在最終的材料成品中需符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1.免疫原及免疫化學(xué)檢驗

基于部分人膠原蛋白核酸序列進行編輯組合而重組的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，特別是長期反復(fù)使用時，可能引起人體預(yù)測不到的免疫原性。因此，不能完全排除其免疫原性風(fēng)險，宜增加免疫學(xué)研究。重組人源化膠原蛋白作為醫(yī)療器械用原材料，可采用適宜方法進行免疫學(xué)評價。若用動物進行免疫學(xué)試驗，可能因為動物模型與臨床應(yīng)用之間存在種屬差異，帶來對評價試驗結(jié)果或評價試驗數(shù)據(jù)使用上的局限，需要根據(jù)臨床評價獲得的免疫學(xué)評價數(shù)據(jù)及動物模型獲得的免疫評價數(shù)據(jù)進行綜合評價分析。

患者對蛋白質(zhì)類材料產(chǎn)生免疫應(yīng)答的風(fēng)險將隨醫(yī)療器械產(chǎn)品變化而變化。建議采用基于風(fēng)險的方法來評價和減輕與影響人源化膠原蛋白安全性和有效性相關(guān)的免疫應(yīng)答。人源化膠原免疫原主要源自生產(chǎn)過程中殘留的可致免疫原性的各種因子，包括殘留的各種雜蛋白（包括DNA轉(zhuǎn)錄過程中可能產(chǎn)生的異種蛋白）、殘留的大腸桿菌及酵母菌外源性DNA、材料致熱原、生產(chǎn)過程中菌體產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素、DAMPs以及人源膠原特異性免疫等等。

為降低人源化膠原蛋白材料的免疫原性風(fēng)險，一般需在材料設(shè)計及生產(chǎn)工藝中采取相應(yīng)處理措施以降低其免疫原性，如宿主細胞選擇，蛋白提取、蛋白純化。注冊申請人需對其降低材料免疫原性的有效性進行驗證，并提供驗證試驗性數(shù)據(jù)或相關(guān)研究資料。注冊申請人需提供免疫原性檢測范例的理論依據(jù)，需使用經(jīng)完全驗證的檢測法對來自關(guān)鍵性研究的樣品進行檢測，并提供支持該檢測法的全面驗證的數(shù)據(jù)。

雜蛋白的檢測可參考YY/T 1453《組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品 I型膠原蛋白表征方法》，外源性DNA檢測可參考YY/T 0606.25《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第25部分 動物源性生物材料DNA殘留量測定法：熒光染色法》。膠原蛋白材料的免疫原檢驗可通過流式細胞術(shù)（FCM）或酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定，檢測試驗宜考慮，但不限于淋巴細胞增殖試驗（YY/T 0606.15《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第15部分 評價基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗方法：淋巴細胞增殖試驗》）、細胞遷移試驗（YY/T 0606.20《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品 第20部分：評價基質(zhì)及支架免疫反應(yīng)的試驗方法：細胞遷移試驗》），采用非標(biāo)方法時需進行方法學(xué)驗證。

免疫原性檢測可設(shè)計為檢測不期望的生物或生理結(jié)果的抗體，重組人源化膠原蛋白抗體可能降低效果或者引起過敏等反應(yīng)?？贵w檢測的免疫原試驗可參考《中華人民共和國藥典》，選擇適宜的方法進行，包括橋聯(lián)或均相酶免疫法、放射免疫沉淀試驗等，并進行相關(guān)的方法開發(fā)和試驗驗證。試驗過程中，可根據(jù)滴度試驗和中和活性試驗進一步對ADA進行分析，還可進行額外的抗體特征分析，包括抗體分型、抗原表位鑒定及交叉反應(yīng)評價。

篩選檢測法（也稱為結(jié)合抗體（BAb）檢測法）用于檢測與材料結(jié)合的所有抗體。使用確證性檢測法建立BAb對材料的特異性，使用滴定和中和檢測法進一步表征重組人源化膠原蛋白抗體。使用滴定檢測法表征抗體應(yīng)答的量級，抗體對安全性和有效性的影響可能與其滴度和持續(xù)性而不是發(fā)生率相關(guān)。中和檢測法評估抗體干擾材料-靶標(biāo)相互作用的能力。中和抗體（NAb）是BAb的亞類，ADA對安全性和有效性的影響可能與NAb活性而不是抗體發(fā)生率相關(guān)。類似地，在一些情況下可能重要的是確定NAb滴度。用于檢測抗體的首選檢測法應(yīng)當(dāng)是檢測低親和力和高親和力抗體的高靈敏度篩選檢測法。注冊申請人在開發(fā)檢測方法以確認重組人源化膠原蛋白特異性抗體結(jié)合時，需選擇合適的確證性檢測法以防止抗體假陽性數(shù)據(jù)，這些假陽性數(shù)據(jù)會混淆抗體對安全性和有效性影響的分析。

注冊申請人需提供支持該檢測法的全面驗證的數(shù)據(jù)。驗證包括證明用于給定樣品中抗體的定量測量的特定檢測法對于預(yù)期用途是可靠和可重現(xiàn)的?？贵w檢測法有助于評價材料的免疫原性，然而抗體的檢測依賴于檢測法的關(guān)鍵操作參數(shù)（如靈敏度、專屬性），一般來說，建議注冊申請人開發(fā)針對靈敏度、專屬性、選擇性、精確度、重復(fù)性和穩(wěn)定性進行優(yōu)化后的檢測法。

其他的免疫原評價及生物學(xué)性能及生物相容性評價等建議做醫(yī)療器械終產(chǎn)品的檢測，因為加工工藝不同最終產(chǎn)品性能不同，例如有些交聯(lián)工藝可能會封閉某些免疫原反應(yīng)簇等等。

2.免疫毒理學(xué)評價

當(dāng)擬生產(chǎn)醫(yī)療器械免疫原性風(fēng)險與已上市產(chǎn)品無可比性，且無充分的文獻數(shù)據(jù)評價其免疫原性，需進行免疫毒理學(xué)試驗研究。通過免疫毒理學(xué)試驗，對炎癥反應(yīng)、免疫抑制、免疫刺激、超敏反應(yīng)以及自身免疫進行確證評價，評估免疫系統(tǒng)改變導(dǎo)致的潛在人體不良健康作用。

免疫毒理學(xué)可通過流式細胞術(shù)（FCM）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、組織病理切片等方法測定，試驗方法可考慮結(jié)合生物學(xué)試驗、體外T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗（YY/T 1465.1《醫(yī)療器械免疫原性評價方法 第1部分 體外T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗》）等，注冊申請人需對選用檢測方法的適用性進行評價，采用非標(biāo)方法時需進行方法學(xué)驗證。

可參考GB/T 16886.20《醫(yī)療器械免疫毒理學(xué)試驗原則和方法》選擇性進行功能性或非功能性免疫毒理學(xué)試驗，通過嚙齒動物試驗方式檢測和評價物質(zhì)的不良作用。目前主要研究方法是將醫(yī)療器械/材料植入小鼠/模式小鼠，然后研究器械/材料整個降解周期內(nèi)機體的體液和細胞的免疫應(yīng)答，以及局部組織的免疫反應(yīng)。功能性檢測測定細胞和/或器官活性，例如淋巴細胞對有絲分裂原或特異性抗原的增殖反應(yīng)、細胞毒性和特異性抗體的形成；非功能性檢測涵蓋形態(tài)學(xué)方面和/或定量的術(shù)語、淋巴組織變化程度、淋巴細胞數(shù)目和免疫球蛋白水平或其他免疫功能標(biāo)志物。

（三）   材料生物學(xué)風(fēng)險評價

作為制備醫(yī)療器械產(chǎn)品的原材料，需參照GB/T 16886.1的要求對重組人源化膠原蛋白原材料進行必要的生物學(xué)評價，尤其通過膠原蛋白材料到醫(yī)療器械終產(chǎn)品的加工工藝分析發(fā)現(xiàn)，兩者之間的生物學(xué)風(fēng)險相近時。如預(yù)期用于植入產(chǎn)品的原材料，還需評估樣品是否為內(nèi)源性凝血系統(tǒng)激活物。若醫(yī)療器械終產(chǎn)品與膠原蛋白材料的使用方法不一致，需考慮生物學(xué)補充研究。

根據(jù)GB/T 42062《醫(yī)療器械 風(fēng)險管理對醫(yī)療器械的應(yīng)用》描述的風(fēng)險管理過程進行生物學(xué)風(fēng)險評定，識別材料、添加劑、加工助劑和其他潛在可瀝濾物中的危害，接觸劑量等因素，繪制基于風(fēng)險管理的生物學(xué)評價流程圖。

如果醫(yī)療器械產(chǎn)品以非滅菌的方式提供，可將樣品滅菌后用于生物學(xué)評價試驗，需考慮滅菌方式及滅菌對重組人源化膠原蛋白的影響。

可能需要評價的生物學(xué)風(fēng)險評定終點包括但不限于：

1.細胞毒性

2.致敏性

注射膠原、膠原止血劑等具有潛在生物可降解性材料，或體內(nèi)植入材料以及材料制備過程中新增了化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物，以及成品中可能存在滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物時，需進行遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗。

3.皮膚刺激性

4.皮內(nèi)反應(yīng)

注射膠原、膠原止血劑等具有潛在生物可降解性材料或體內(nèi)植入材料以及材料制備過程中新增化學(xué)成分和制造加工助劑、裝配粘合劑/溶劑殘留物以及滅菌殘留物或滅菌過程所致的反應(yīng)性產(chǎn)物可能存在于成品時需進行皮內(nèi)刺激試驗。

5.材料介導(dǎo)的致熱性

6.全身毒性

7.溶血性

血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血劑、心臟瓣膜等與循環(huán)血液接觸的外部接入材料和大部分植入材料以及全部植入血管系統(tǒng)材料需進行溶血試驗。

8.植入反應(yīng)

皮下植入（膠原支架、血管修復(fù)材料、創(chuàng)傷和燒傷修復(fù)材料、膠原止血劑等可降解/可吸收材料或需植入生物材料等需進行皮下組織植入試驗進行評價）；肌肉植入；骨植入。

9.遺傳毒性。

（四）   穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究

1.穩(wěn)定性研究

重組人源化膠原蛋白生產(chǎn)過程中間體如涉及到貯存，則需開展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運輸（如適用）和使用穩(wěn)定性研究等。研究開展前，需統(tǒng)籌制定穩(wěn)定性研究方案，關(guān)注各穩(wěn)定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測時間點、檢測條件和分析檢項等。

研究中需對能夠反映質(zhì)量變化的敏感特征進行研究，如含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學(xué)特性等。需依據(jù)相應(yīng)的醫(yī)療器械產(chǎn)品的貯存運輸條件開展研究，涵蓋設(shè)定的各項條件，如溫度、光照、反復(fù)凍融（冷凍貯存時）、振搖等方面。根據(jù)實際使用情況，開展使用中的穩(wěn)定性研究，例如復(fù)溶或解凍、與復(fù)溶稀釋劑的相容性研究等。研究中需采用與實際使用相同材質(zhì)的直接接觸性容器/材料。

2.直接接觸性容器/材料研究

如涉及貯存，需對直接接觸的包裝容器開展相應(yīng)的包材相容性研究。根據(jù)相容性研究結(jié)果，結(jié)合穩(wěn)定性研究，選擇合理的包裝容器。

另外，對制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質(zhì)、管路等），需開展風(fēng)險評估和/或相應(yīng)的相容性研究。

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附件：重組人源化膠原蛋白原材料制造過程控制

附件

重組人源化膠原蛋白原材料制造過程控制

制造過程控制主要涉及工程細胞構(gòu)建過程、生產(chǎn)用細胞的質(zhì)量控制及常規(guī)生產(chǎn)過程控制。本附件特別關(guān)注了較為復(fù)雜的動物細胞生產(chǎn)體系，細菌與酵母的生產(chǎn)過程控制需首先符合中國藥典第三部中《生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制》的要求。植物與昆蟲體系制造重組人源化膠原蛋白，可參考本附件中適用的內(nèi)容并制定相應(yīng)的控制要素。

一、重組工程細胞構(gòu)建及生產(chǎn)用細胞的質(zhì)量控制

重組人源化膠原蛋白屬于采用重組DNA技術(shù)，對編碼所需人膠原蛋白的基因進行遺傳修飾，利用質(zhì)粒等載體將目的基因?qū)脒m當(dāng)?shù)乃拗骷毎?，表達并翻譯成蛋白質(zhì)，經(jīng)過提取和純化等步驟制備而成的重組膠原蛋白之一。

（一）工程細胞的構(gòu)建

1.宿主細胞的選擇、來源、歷史和一般特性

經(jīng)過全面檢測的種子細胞是實現(xiàn)重組人源化膠原蛋白材料生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)。生產(chǎn)用種子細胞需具有共同的始祖細胞，保持相同的遺傳和生物學(xué)特征，在特定的培養(yǎng)環(huán)境和條件下持續(xù)穩(wěn)定表達攜帶的外源目的基因。建議詳細闡述共同始祖細胞的判定標(biāo)準(zhǔn)。只有經(jīng)過研究確定細胞在擴增培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中的變化，才能夠有效控制風(fēng)險性因素，滿足生產(chǎn)的持續(xù)需求，使膠原蛋白材料質(zhì)量保持一致。

本附件中的宿主細胞主要涵蓋來自于人或動物的細胞系或者微生物細胞，動物來源的細胞系可來自所有后生動物，包括體外永生化的傳代細胞系以及有限傳代的二倍體細胞。微生物的來源包括細菌、真菌、酵母和其他單細胞生物。在宿主細胞選擇、重組工程細胞構(gòu)建以及生產(chǎn)細胞的培養(yǎng)擴增和監(jiān)控過程中，不僅要關(guān)注細胞的適用性、目的產(chǎn)物表達生產(chǎn)能力，同時還需重視伴隨細胞培養(yǎng)產(chǎn)生的內(nèi)源性病毒、宿主細胞殘余蛋白和DNA、致腫瘤成分等潛在的風(fēng)險性因素對重組人源化膠原蛋白材料帶來的安全性影響。在早期研究階段，需同步開展庫細胞、生產(chǎn)培養(yǎng)過程細胞、生產(chǎn)終末細胞的全面檢定和控制。針對哺乳動物細胞，需進行病毒和/或致瘤性成分的去除/滅活工藝的驗證。

需選擇來源、背景十分清楚的適宜宿主細胞，明確存在的內(nèi)源性病毒和/或致瘤性等影響膠原蛋白材料安全性的因素，并結(jié)合膠原蛋白材料純化的程度、細胞培養(yǎng)和生產(chǎn)過程中風(fēng)險性成分的去除/滅活能力及殘留量控制水平，以及臨床應(yīng)用適應(yīng)證和用法用量等特點綜合分析，經(jīng)利弊權(quán)衡后確定與特定膠原蛋白材料相適應(yīng)的宿主細胞。盡可能選擇致瘤性試驗陰性和低增殖代次水平的宿主細胞。對于改良的傳代細胞、全新構(gòu)建的轉(zhuǎn)化細胞，甚至腫瘤細胞等，由于前期研究、背景資料和致瘤性風(fēng)險等積累的認識有限，其開發(fā)應(yīng)用將引入新的安全性隱患，需要慎重權(quán)衡利弊，確保遺傳背景清晰，在開展充分研究的基礎(chǔ)上嚴格控制其潛在的風(fēng)險性。

用于構(gòu)建重組工程細胞的宿主細胞其來源和培養(yǎng)歷史需足夠清楚，可溯源有關(guān)的背景資料。例如最初分離建立株/系的機構(gòu)，在不同機構(gòu)內(nèi)引進和傳代經(jīng)過，既往進行過的檢測分析項目和確證研究結(jié)果，細胞保存狀態(tài)，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)已達到的增殖代次/水平及傳代過程中所用過的人源或動物源性材料等。需提供宿主細胞來源的相關(guān)資料和證明性文件，說明是否曾進行過遺傳操作引入了外源基因序列，描述已進行過的研究檢定項目例如細胞鑒定、內(nèi)源和外源性因子檢測等的結(jié)果及引進時進行的復(fù)核檢定結(jié)果。對于微生物細胞而言，需提供產(chǎn)生細胞系的物種、株和已知的遺傳和表型特征。如可能，還需提供其致病性、毒素產(chǎn)物和其他生物危害方面的資料。需說明所用細胞基質(zhì)的細胞來源(實驗室制備或來源于菌種庫)，引證科學(xué)文獻上的相關(guān)參考資料。直接從實驗室獲得的資料是首選的，如果沒有這些資料，也可以利用文獻。

需闡述宿主細胞的基本特征，如形態(tài)、培養(yǎng)和生長一般特征、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)液要求，新構(gòu)建的動物細胞系需檢測致瘤性特征。對宿主系統(tǒng)（原核、真核、哺乳細胞等）的特性、遺傳背景、基因型、表型、抗性、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化條件特征都需有詳細的文獻或?qū)嶒炠Y料?；咎卣餍畔⑴e例如表1。

2.宿主細胞鑒定

宿主細胞（原核、真核、哺乳細胞等）污染和營養(yǎng)缺陷表型(或基因敲除)、過表達及導(dǎo)入外源基因等鑒定檢測方法都需有詳細的文獻或?qū)嶒炠Y料。舉例如表2。

3.重組工程細胞克隆構(gòu)建過程、篩選及相關(guān)鑒定

工程細胞的構(gòu)建一般包括基因獲得、質(zhì)粒構(gòu)建和表達體系構(gòu)建三個階段。舉例如圖1。

目前可采用多種表達載體、宿主細胞、基因?qū)敕椒ê秃Y選標(biāo)記等進行工程細胞的構(gòu)建和篩選，構(gòu)建成功的標(biāo)志是工程細胞能夠穩(wěn)定、高效地表達結(jié)構(gòu)正確且具有生物活性的目的產(chǎn)物，包括共表達的產(chǎn)物。因此，需盡可能提供關(guān)于重組工程細胞構(gòu)建和鑒定的詳細資料，重點描述的內(nèi)容舉例如表3。

3.1目的基因來源及插入目的基因的設(shè)計

需包括最初獲得目的基因序列的來源和背景方面的資料，包括但不限于用于制備目的基因cDNA的方法，以及必要的初步序列分析。

需根據(jù)人膠原蛋白的氨基酸序列和學(xué)術(shù)研究，檢索公開數(shù)據(jù)庫，如美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）生物信息數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、公開發(fā)表的蛋白質(zhì)學(xué)術(shù)論文等，獲取人膠原蛋白的氨基酸序列及其對應(yīng)的核酸序列，包括全長人氨基酸序列、片段人氨基酸序列、片段重復(fù)人氨基酸序列等。衡量目的基因質(zhì)量時至少需考量下述項目：

根據(jù)所選的核酸序列及質(zhì)粒進行插入目的基因的設(shè)計，明確插入位點、標(biāo)簽序列或分泌表達信號肽。將目的插入序列翻譯成氨基酸序列，需提供該序列與人膠原蛋白氨基酸序列比對圖。帶有非膠原蛋白設(shè)計與修飾(標(biāo)簽、抗性等)，則需提供具體序列及修飾位點，最終產(chǎn)物的膠原蛋白序列與修飾需符合相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3.2載體選擇與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

需詳述表達載體構(gòu)建或改建的過程，對構(gòu)建成功的表達載體需進行必要的鑒定，并提供相關(guān)試驗資料如構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜等。根據(jù)設(shè)計的重組人源化膠原蛋白氨基酸導(dǎo)入宿主細胞的不同，選擇合適的質(zhì)粒以滿足目標(biāo)克隆的構(gòu)建，并提供質(zhì)粒的完整序列信息。舉例如下：

需提供有關(guān)表達載體詳細資料，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達載體的構(gòu)建、結(jié)構(gòu)和遺傳特性。需說明表達載體組成成分以及主要元件的來源和功能，包括插入基因和側(cè)翼區(qū)序列、復(fù)制子、啟動子、增強子、抗性標(biāo)記以及主要的酶切位點等。提供至少包括構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜。

將目的基因序列插入質(zhì)粒中時，為保證重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，需提供重組質(zhì)粒至少含目的插入基因完整開放讀碼框的測序報告，并提供測序序列與設(shè)計序列的比對結(jié)果，二者需一致。需提供插入基因和表達載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達有關(guān)的序列均需詳細敘述。主要質(zhì)量控制參數(shù)舉例：

需明確質(zhì)粒與菌種/細胞的儲存條件，例如質(zhì)粒溶液為-20℃，甘油菌為≤-60℃，等等。

3.3載體引入宿主細胞的方法及重組工程細胞的篩選

需詳細說明載體引入宿主細胞的方法和操作過程，重組工程細胞的篩選原理、條件和標(biāo)準(zhǔn)，以及采用何種方法增加基因拷貝數(shù)等。闡述外源基因引入宿主細胞后產(chǎn)生的變化，符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的候選細胞可能為多個細胞株，但擬用于建庫的細胞株需為經(jīng)研究比較后確定的單一細胞克隆。

3.3.1載體引入宿主細胞的方法

非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)可通過物理、化學(xué)或生物轉(zhuǎn)導(dǎo)方式遞送進入細胞。進入目的細胞后，通過轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯等方式發(fā)揮作用。

外源基因?qū)胧荏w細胞有多種方法，宿主細胞類型不同，載體不同，導(dǎo)入方法也有差異。舉例如大腸桿菌屬于原核生物，常用的是熱擊轉(zhuǎn)化方法，將重組表達載體DNA分子轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞。酵母生長較迅速且細胞分散，常用的酵母細胞轉(zhuǎn)化方法包括氯化鋰、電穿孔、基因槍和玻璃珠方法。這些方法常用于釀酒酵母，但也可用于其他真菌轉(zhuǎn)化，如酵母（例如粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和畢赤酵母）和絲狀真菌（例如曲霉屬菌種）。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體和胞核微注射法等，各種轉(zhuǎn)染方法的作用機制、轉(zhuǎn)染效率和優(yōu)缺點各不相同。

若采用基因編輯系統(tǒng)，建議對靶向序列、目的基因序列和基因編輯用酶等的序列和比例等進行優(yōu)化。通過特定細胞中的基因編輯效果確認基因編輯用酶和靶向序列的特異性，篩選最佳的靶向結(jié)合序列（如sgRNA序列），并采取措施降低基因脫靶、插入突變的概率及對目的細胞基因組穩(wěn)定性的不良影響。對于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，建議考慮整合位點的特異性和分布趨勢，以及轉(zhuǎn)座子在基因組中的移動（genomicmobilization）等特征，進行轉(zhuǎn)座子序列、轉(zhuǎn)座酶及相應(yīng)調(diào)控元件的優(yōu)化，合理設(shè)置轉(zhuǎn)座序列/轉(zhuǎn)座酶的比例、序列分布等。

3.3.2重組工程細胞的篩選

需檢測重組后細胞基本性狀的改變，比較研究插入外源基因后細胞致瘤性特征的改變。需說明表達載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài)（是否整合到染色體）并采用適宜的方法測定其拷貝數(shù)，需提供宿主和載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性資料。說明啟動和控制目的基因在宿主細胞中表達所采用的方法，并進行初步的表達產(chǎn)物鑒別和表達水平檢測。

對于選定的工程細胞株需進行充分的目的基因全序列確認，以保證用于編碼和表達目的產(chǎn)物的基因在初始核酸序列上的正確性。需詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動和控制克隆基因在宿主細胞中的表達所采用的方法及表達水平。

3.4合成表達系統(tǒng)構(gòu)建過程中關(guān)鍵質(zhì)量控制

此過程的質(zhì)量研究通常包括鑒別、結(jié)構(gòu)特征、理化特性、生物學(xué)活性、純度和雜質(zhì)分析等，建議采用多個代表性批次開展研究。

3.4.1鑒別和序列確認

鑒別研究中，可采用限制性內(nèi)切酶進行酶切，對酶切產(chǎn)物進行電泳分析，觀察是否存在特征性的帶型；也可以用PCR方法進行擴增，分析片段大小是否與理論大小一致等方法。序列確認研究中，建議開展全序列測定，重點關(guān)注目的基因和調(diào)控元件的序列正確性。

3.4.2結(jié)構(gòu)

建議采用適用的方法對結(jié)構(gòu)完整性和大小均一性進行研究。如對于DNA，可關(guān)注其是否存在單鏈、雙鏈、線性/開環(huán)、環(huán)狀和超螺旋等多種結(jié)構(gòu)形式，以及可能的高級結(jié)構(gòu)等。

3.4.3理化特性

建議開展分子量、核酸濃度/含量、修飾位點及比例（如有）、物理特性（如pH、滲透壓）等方面的研究。

3.4.4生物學(xué)活性

根據(jù)作用機制，生物學(xué)活性研究通常包括對基因修飾效率、目的基因表達的水平、表達產(chǎn)物的功能或體外模擬生理功能的測定等。建議首選定量檢測方法，如可通過目的基因或基因編輯產(chǎn)物的表達量和功能進行分析，關(guān)注表達產(chǎn)物是否與預(yù)計一致或蛋白表達/基因是否被抑制、空間結(jié)構(gòu)是否符合設(shè)計（如多聚體）等。當(dāng)采用體外轉(zhuǎn)染檢測細胞的方法時，需關(guān)注選擇的檢測細胞是否具有代表性和合理性。

3.4.5其他特性研究

對于使用基因編輯工具酶的修飾系統(tǒng)，質(zhì)量研究中建議持續(xù)關(guān)注對應(yīng)細胞中修飾系統(tǒng)的殘留情況，采用生物信息學(xué)工具分析靶細胞基因組結(jié)構(gòu)變化、單點和小規(guī)模基因突變以及外源DNA在基因組中的插入位置、拷貝數(shù)等，監(jiān)控基因編輯用酶的細胞內(nèi)持續(xù)表達時間，考察脫靶效應(yīng)及相應(yīng)的安全性影響等。對于制備過程中使用的酶類試劑，建議重點關(guān)注酶的功能活性，例如需關(guān)注所用DNA聚合酶的保真度和活性，消化酶的酶解作用、酶的非特異性消化條件等，同時需要關(guān)注酶的純度、生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)等。對于核苷酸、5’-帽或帽類似物等原材料，其整體的質(zhì)量需符合制備的要求，建議關(guān)注鑒別、濃度、純度和雜質(zhì)等。制備過程建議避免使用氯化銫、溴化乙錠、氯仿等毒性物質(zhì)，避免使用動物源胰蛋白胨、核酸酶等可能引入外源因子等風(fēng)險的原材料。對于用作遞送系統(tǒng)的材料，其制備涉及的關(guān)鍵原材料（脂質(zhì)、陽離子聚合物等）需進行充分的篩選和質(zhì)量控制。

（二）生產(chǎn)用細胞的質(zhì)量控制

連續(xù)傳代細胞生產(chǎn)重組人源化膠原蛋白材料的最大優(yōu)點是使每批膠原蛋白材料都有一個經(jīng)過檢定的共同起源細胞，因此建立細胞庫的目的就是為了保證生產(chǎn)的可持續(xù)性和膠原蛋白材料質(zhì)量的穩(wěn)定。重組人源化膠原蛋白材料的生產(chǎn)必須建立在有良好的細胞庫管理基礎(chǔ)上，載體細胞可以是細菌、酵母或其他真核細胞，已通過篩選、育種、復(fù)蘇等程序驗證建立細胞庫而實現(xiàn)工程化，具有穩(wěn)定的遺傳表達和相應(yīng)的質(zhì)量控制體系。本部分以針對動物細胞庫的管理為例，進行相關(guān)闡釋。

需建立細胞庫系統(tǒng)（細菌、酵母、哺乳細胞等其他）保存管理的相應(yīng)制度及文件，保證細胞庫符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求，保障細胞庫的穩(wěn)定性，需對細胞庫進行質(zhì)量檢測，包括質(zhì)粒核酸序列、拷貝數(shù)、丟失率檢測；雜菌檢測（計數(shù)、菌落形態(tài)觀察、菌種鑒定）等；需提供細胞庫檢測報告。

1.細胞庫建立

細胞庫可為三級即原始細胞庫、主細胞庫（MCB）和工作細胞庫（WCB）；也可采用主細胞庫和工作細胞庫組成的兩級細胞庫；在某些特殊情況下，也可使用主細胞庫一級庫。用于建庫的初始工程細胞株需為經(jīng)過克隆選擇而形成的均一細胞群體，必要時須經(jīng)與實際生產(chǎn)過程所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件相一致的適應(yīng)性培養(yǎng)。

2.建庫細胞的管理

在制備工作細胞庫過程中不得進行單克隆篩選，以避免由于個別基因突變引起工作細胞庫中細胞群體性的遺傳特性改變；為了保證細胞庫中每個容器中的內(nèi)容物完全一致，如培養(yǎng)細胞采用幾個器皿的，需將所有培養(yǎng)皿中的細胞混合成單批后再分裝。

在細胞庫的建庫期間需采取適宜的預(yù)防措施，以確保細胞不被污染（包括微生物污染和實驗室中其他類型細胞的交叉污染等）。各級種子庫的細胞需按照特定的要求經(jīng)過全面檢定合格后方可使用（具體要求參見本文細胞庫檢定）。

動物細胞庫建庫的具體過程、方法和管理需符合中國藥典要求。

3.細胞庫檢定

正確的起始細胞是實現(xiàn)良好生產(chǎn)的前提和基礎(chǔ)。檢定的目的是為了確認經(jīng)過初步篩選建庫的細胞符合預(yù)期設(shè)計要求，攜帶有穩(wěn)定的目的基因，能夠持續(xù)表達有功能活性的目的產(chǎn)物，沒有微生物污染和混雜其它細胞，能夠直接擴增儲備或者應(yīng)用于生產(chǎn)。

對于原始庫細胞和/或主庫細胞，通常需要進行一次全面系統(tǒng)的研究檢定，包括遺傳學(xué)、生物學(xué)和微生物學(xué)，以便從源頭開始嚴格控制起始細胞的一致性和防止污染。經(jīng)過傳代穩(wěn)定性研究的主細胞到工作細胞，只經(jīng)過簡單的傳代、擴增，可以適當(dāng)簡化檢定項目，重點檢測外源因子污染和防止混入了其它細胞。保存的數(shù)目和傳代水平需保證生產(chǎn)用細胞的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)。

3.1細胞鑒定

要進行目的蛋白表達穩(wěn)定性分析，即確證表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)序列與預(yù)期相符。

3.1.1細胞種屬的鑒定

需驗明細胞的種屬來源，分析細胞的同一性，排除與其它細胞的交叉污染。鑒別試驗可利用細胞的表型或遺傳型特征，通常對MCB作鑒別試驗，而對每個WCB僅作有限的鑒別試驗。

目前常用的方法有細胞生長特征和培養(yǎng)形態(tài)學(xué)檢查、種屬特異性抗原檢測、染色體核型分析、同工酶分析、限制性內(nèi)切酶分析、基因多態(tài)性分析等。需結(jié)合具體細胞固有的特性進行適宜的組合和選擇，以實現(xiàn)正確鑒別為目的。

真核細胞用于生產(chǎn)時，細胞的鑒別標(biāo)志，如特異性同功酶或免疫學(xué)或遺傳學(xué)特征，對鑒別所建立的種子是有用的。有關(guān)所用傳代細胞的致癌性需有詳細報告。如采用微生物培養(yǎng)物為種子，則需敘述其特異表型特征。

3.1.2致瘤性試驗

對于動物細胞，需檢測分析目的基因引入細胞后的致瘤性特征，對于陽性細胞，需研究確定致瘤性改變對膠原蛋白材料帶來的安全性風(fēng)險。種子批不應(yīng)含有外源致癌因子。

3.1.3目的基因和表達框架分析

目的基因和表達框架的確證是種子庫細胞檢定的重要組成部分，對于表達正確的目的產(chǎn)物具有先決性意義。常用的方法包括：通過PCR擴增樣本DNA來進行DNA序列分析；通過限制性內(nèi)切酶譜和Southern雜交來檢測基因的完整性，確定目的基因的拷貝數(shù)，并檢測是否有任何序列插入或缺失等。

基因序列分析資料需包括試驗方案和步驟、原始的測序圖、測得序列以及翻譯后的氨基酸序列，同時需將實際測得序列與理論序列進行對比。清楚標(biāo)注兩者之間的異同。一般情況下，在原始種子階段需確證克隆基因的DNA序列。但在某些情況下，例如傳代細胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對克隆基因作DNA序列分析。在此情況下，可采用總細胞DNA的雜交印染分析，或作mRNA的序列分析。對最終膠原蛋白材料的特征鑒定需特別注意。

為保證膠原蛋白材料結(jié)構(gòu)的正確和穩(wěn)定，基因序列分析需貫穿于重組工程細胞的篩選和鑒定、細胞庫的建立和檢定以及生產(chǎn)細胞培養(yǎng)監(jiān)控的全過程。

3.1.4表達產(chǎn)物檢測

需檢測分析目的產(chǎn)物的表達量和生物活性。活性測定需選擇與其預(yù)期用途相對應(yīng)并能夠定量的方法?；钚詼y定方法學(xué)研究可貫穿于重組人源化膠原蛋白原材料研究的始終，并經(jīng)相關(guān)驗證分析。

3.2微生物污染檢測

3.2.1細菌、真菌和支原體檢查

對于動物細胞庫，需對MCB、WCB和EPC（生產(chǎn)終末期細胞）進行全面檢查，對生產(chǎn)培養(yǎng)過程中的細胞進行監(jiān)測。在進行支原體檢查時，需注意同時進行培養(yǎng)法和指示細胞法兩種方法，或經(jīng)驗證的qPCR法。必要時可采用掃描電鏡法檢查細胞是否受到特殊微生物的污染。在設(shè)計檢測微生物細胞庫中外源微生物因子和外源細胞污染的特異性試驗方法時，需考慮以下問題：建庫細胞的性質(zhì)、科技文獻中報道的可能存在的污染、用于細胞培養(yǎng)的細胞來源、方法和材料以及存在于建庫實驗室中的其他生物等。

3.2.2病毒因子的檢查

包括細胞來源宿主動物潛在的內(nèi)源性病毒和由于操作帶入的外源性病毒的檢查。對細胞進行病毒檢查的種類和方法，需根據(jù)細胞的種屬和組織來源、傳代歷史和細胞特性選擇。

3.2.1.1體外試驗

需將MCB、WCB和EPC細胞活細胞或細胞裂解產(chǎn)物接種到盡可能多的病毒易感的指示細胞上。可以根據(jù)細胞來源，傳代史和細胞培養(yǎng)基的原料使用情況來選擇適宜的指示細胞。檢測結(jié)果需為陰性。

3.2.1.2體內(nèi)試驗

通過接種乳鼠、成年小鼠、雞胚、豚鼠、家兔或其它敏感動物來檢測細胞培養(yǎng)物中潛伏性病毒。通常要對MCB、EPC進行體內(nèi)試驗。

3.2.1.3種屬特異性病毒的檢定

通過抗體產(chǎn)生試驗來檢測可能存在于MCB細胞中的種屬特異性病毒，如嚙齒類動物來源的細胞需進行小鼠、倉鼠或大鼠的抗體生成試驗。嚴格控制對于人類有危害的鼠源性病毒。

3.2.1.4逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測

逆轉(zhuǎn)錄病毒的試驗需包括感染性試驗、逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）檢測和電鏡技術(shù)檢查。需采用上述方法對MCB和EPC細胞進行逆轉(zhuǎn)錄病毒的檢測。

3.2.1.4.1感染性試驗

需根據(jù)細胞的特性及可能存在的逆轉(zhuǎn)錄病毒種類選擇適宜的檢測方法，如XC空斑試驗（XC plaque）、延時XC空斑試驗、S＋L－灶點分析（S＋L－Focus）等。試驗時需注意設(shè)立恰當(dāng)?shù)年?陽性對照。

3.2.1.4.2逆轉(zhuǎn)錄酶檢測

為提高檢測的敏感性，通常需要將受試細胞經(jīng)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后，收集上清液分別與檢測細胞聯(lián)合培養(yǎng)，再檢測逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，注意設(shè)立恰當(dāng)?shù)年?陽性對照。

3.2.1.4.3透射電鏡檢查

透射電鏡下可觀察細胞基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征以及逆轉(zhuǎn)錄病毒和病毒樣顆粒的存在，需比較未經(jīng)和經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細胞。另外，需要對細胞培養(yǎng)液超速離心后所得的沉淀物經(jīng)負染后進行檢查。觀察有無逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒以及顆粒的類型。

上述三種方法具有不同的檢測特性和靈敏度。因此，需采用不同的方法聯(lián)合檢測。若逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測陽性時，建議進行透射電鏡檢查或感染性試驗，如果確證對人或者其它靈長類動物細胞有感染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，該細胞不可用于生產(chǎn)。

4.細胞穩(wěn)定性研究

需包括庫細胞、生產(chǎn)過程中細胞、生產(chǎn)終末期和/或超過生產(chǎn)終末期等不同培養(yǎng)時期的細胞。庫細胞需重點考察貯存、復(fù)蘇等操作處理因素的影響和傳代過程中的遺傳穩(wěn)定性，在此基礎(chǔ)上確定庫細胞傳代限度，也需基于質(zhì)?？截悢?shù)及其在載體細胞內(nèi)的狀態(tài)限定生產(chǎn)過程中載體細胞的最高傳代次數(shù)，驗證試驗所涉及的傳代范圍需等于或超過規(guī)定的細胞最高限定代次。生產(chǎn)過程中細胞、生產(chǎn)終末期和/或超過生產(chǎn)終末期細胞需考察模擬生產(chǎn)工藝和培養(yǎng)條件對細胞生長狀況、表達能力等的影響，并確定生產(chǎn)細胞增殖限度和/或連續(xù)培養(yǎng)時間；使細胞始終能夠持續(xù)、穩(wěn)定地表達重組人源化膠原蛋白，并將對最終膠原蛋白原材料產(chǎn)生安全性影響的風(fēng)險因素嚴格控制在最低限度。

4.1貯存條件下的穩(wěn)定性

當(dāng)儲存的細胞復(fù)蘇后用于生產(chǎn)膠原蛋白材料時，需進行細胞存活率和功能活性等與細胞質(zhì)量密切關(guān)聯(lián)項目的研究測定，以證實復(fù)蘇細胞表達能力的穩(wěn)定性，需有對建庫細胞貯存條件下穩(wěn)定性監(jiān)測的方案。這種監(jiān)測需在一支或多支冷凍保藏的WCB復(fù)蘇后制備生產(chǎn)用細胞時進行，或當(dāng)一支或多支冷凍保藏的MCB復(fù)蘇并用于制備新WCB時進行。如果長時間未進行生產(chǎn)時，需按上市申請時所述的間隔時間對生產(chǎn)用細胞庫進行活力測試。如果細胞的活力沒有明顯的減退，一般不需對MCB或WCB作進一步檢定。

4.2傳代/擴增過程中的穩(wěn)定性

需對庫細胞和生產(chǎn)過程細胞進行傳代/擴增的穩(wěn)定性研究，可將復(fù)蘇的庫細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)至一定的代次和將工作庫細胞在模擬實際生產(chǎn)條件下連續(xù)培養(yǎng)、擴增（逐級放大擴增過程），直至預(yù)期培養(yǎng)時間以及超過預(yù)期時間之外的延長時間點，收獲后進行檢測分析。通過考察目的基因、表達框架等在重組工程細胞中的傳代穩(wěn)定性和目的產(chǎn)物表達的穩(wěn)定性，制定庫細胞的限傳代次和生產(chǎn)細胞的增殖限度以保證實際生產(chǎn)過程中細胞整體擴增水平以及伴隨的內(nèi)源性病毒和/或致瘤性風(fēng)險等的抑制狀態(tài)在預(yù)期限度范圍內(nèi)。至少需包括以下方面的試驗研究：

4.2.1基因水平的比較

目的基因編碼序列和表達框架不應(yīng)有錯誤，包括突變、缺失、插入。并注意比較基因拷貝數(shù)的變化。

4.2.2目的產(chǎn)物表達水平的比較

目的產(chǎn)物的表達量和表達活性不應(yīng)有明顯降低，根據(jù)不同的重組人源化膠原蛋白和具體研究結(jié)果確定適宜的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

4.2.3細胞自身的穩(wěn)定性

需重點檢測細胞在傳代/擴增過程中的形態(tài)、生長、代謝等基本狀況，遺傳特征和致腫瘤特性的變化。

4.2.4內(nèi)源因子檢查

需動態(tài)考察內(nèi)源因子的復(fù)制是否得到有效抑制。重點檢測由細胞來源動物和宿主細胞特性所決定的易染病毒如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，分析其對于人類的致病性和重要性，嚴格控制其產(chǎn)生的條件。

4.2.5致瘤性監(jiān)測

對于致瘤性試驗陽性的細胞，尤其對動物細胞，需通過比較研究考察細胞培養(yǎng)傳代過程中致瘤性特征的改變，例如試驗陽性時的細胞代次、最低接種量、腫瘤轉(zhuǎn)移擴散、腫瘤增殖時間、瘤組織病理特征等。建議對不同劑量（低、中、高）進行不同宿主細胞的致瘤性試驗，直至篩選出低致瘤性細胞。

5.生產(chǎn)過程細胞質(zhì)量控制

種子庫細胞需在全面質(zhì)量研究和檢測分析基礎(chǔ)上，模擬實際生產(chǎn)過程進行擴增培養(yǎng)，并檢測分析目的基因表達的穩(wěn)定性、細胞生長狀況、污染控制、致腫瘤風(fēng)險性等；規(guī)模化生產(chǎn)后須建立細胞生產(chǎn)培養(yǎng)過程的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)細胞培養(yǎng)終末期需符合質(zhì)量控制相關(guān)要求。

對于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒和/或致瘤性試驗陽性的細胞，需依據(jù)工藝處理能力制定風(fēng)險性成分的控制條件，并根據(jù)模擬生產(chǎn)狀態(tài)下取得的試驗研究數(shù)據(jù)制定廢棄收獲液的標(biāo)準(zhǔn)；生產(chǎn)工藝須包括有效的病毒和/或致瘤性成分的滅活/去除方法并經(jīng)過充分驗證。

如果整個培養(yǎng)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)例如培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間和/或限制代次、培養(yǎng)方式等發(fā)生重大改進，細胞培養(yǎng)工藝進行了放大，影響了原已確定的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，需重復(fù)進行一次全面的檢測驗證。

5.1常規(guī)生產(chǎn)過程監(jiān)控

經(jīng)研究確定了生產(chǎn)工藝條件之后，常規(guī)生產(chǎn)過程中可重點監(jiān)測微生物污染和細胞生長狀況，例如活細胞數(shù)目和形態(tài)、代謝和功能狀態(tài)、目的蛋白表達狀況、潛伏性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組激活狀況、細菌和支原體污染以及其它要求等，在比較分析的基礎(chǔ)上確定批次或者連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)的終末細胞的檢測項目及可接受標(biāo)準(zhǔn)。

5.2細胞增殖限度

在細胞穩(wěn)定性試驗研究的基礎(chǔ)上，需結(jié)合細胞培養(yǎng)、維持等工藝過程中實際采用的生產(chǎn)方式如批式培養(yǎng)（batch culture）、流加培養(yǎng)(fed-batch culture)、灌注培養(yǎng)(perfusion culture)等各自特點，考察細胞體外連續(xù)擴增、培養(yǎng)過程中發(fā)生的變化，例如細胞的生長狀態(tài)、內(nèi)源性病毒抑制狀態(tài)、目的蛋白表達的下降程度以及致瘤性改變等確定適宜的收獲方式、收獲時間、細胞終止培養(yǎng)時間和/或增殖代次，并預(yù)留充分的安全儲備。實際生產(chǎn)過程中細胞不得超過預(yù)先設(shè)定的培養(yǎng)時間和/或增殖限度

5.3其它風(fēng)險性因素控制

培養(yǎng)基對細胞的質(zhì)量有直接的影響，也是細胞污染的可能來源之一。需明確培養(yǎng)基的組成、來源及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對于動物源性添加成分，需盡可能控制并減少其使用；如確需使用，需闡明選擇的理由，并說明該成分的來源和病毒安全性控制方法。目前提倡采用無血清培養(yǎng)基，并盡可能減少用于處理細胞（例如從貼壁狀態(tài)中游離或者分散）的動物來源的蛋白酶。各種培養(yǎng)基的來源和質(zhì)量檢測數(shù)據(jù)均需有可追溯的文件記錄。如培養(yǎng)中使用了牛源性物質(zhì)，需明確其來自非BSE疫區(qū)，并需按照國家食品藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)規(guī)定提供必要的證明性文件。

細胞培養(yǎng)條件的研究中，需考察使內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制和癌基因相關(guān)序列激活或者復(fù)制受抑制的控制條件，對模擬生產(chǎn)條件下的狀況進行分析，確定可實際控制的程度。生產(chǎn)中需嚴格執(zhí)行研究確定的控制條件。

6.風(fēng)險評估與控制

細胞系/庫的建立，其序列的設(shè)計、生產(chǎn)用材料、制備工藝、質(zhì)量、穩(wěn)定性、內(nèi)包材的要求可依具體情況，結(jié)合細胞系/庫的質(zhì)量研究結(jié)果進行綜合評估。可結(jié)合生產(chǎn)使用情況和細胞系/庫的研究和檢測情況，制定重組人源化膠原蛋白原材料的風(fēng)險控制策略。良好的重組人源化膠原蛋白原材料質(zhì)量研究與控制有利于篩選、建立出質(zhì)量良好的細胞系/庫，有利于后續(xù)的生產(chǎn)研究。在細胞系/庫建立過程中，建議對細胞系/庫進行檢定和傳代穩(wěn)定性研究，關(guān)注細胞系/庫功能是否符合理論設(shè)計和預(yù)期、安全是否可控，必要時對工程細胞進行相應(yīng)的質(zhì)量研究，以確認其適用性。

隨著技術(shù)不斷更新和研究經(jīng)驗的逐步積累，研發(fā)過程常常伴隨重組人源膠原合成表達系統(tǒng)的升級和工藝的優(yōu)化，因此研發(fā)各階段有可能發(fā)生變更。系統(tǒng)的變更可能顯著影響工程細胞的安全性和有效性，是重要風(fēng)險之一，研發(fā)者需評估變更引入的影響和風(fēng)險。根據(jù)風(fēng)險評估情況，對重組人源膠原合成表達系統(tǒng)及其工程細胞的質(zhì)量、工藝控制、穩(wěn)定性等方面進行深入研究，合理設(shè)計變更可比性研究方案。

二、常規(guī)生產(chǎn)過程控制

重組人源化膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特性容易受到各種理化因素的影響，且分離提純工藝復(fù)雜，因此其質(zhì)量控制體系是針對生產(chǎn)全過程，采用化學(xué)、物理和生物學(xué)等手段而進行的全程、實時的質(zhì)量控制。生產(chǎn)過程中每一環(huán)節(jié)或制備條件的改變均可能影響其非臨床安全性評價的合理性。

（一）載體制備工藝

不同目的基因和表達載體的載體制備工藝可能有差異。以質(zhì)粒DNA為例，其制備步驟一般包括微生物培養(yǎng)及發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、質(zhì)粒純化、濃縮、灌裝等。工藝研究與確定過程需對關(guān)鍵工藝參數(shù)進行探索和優(yōu)化，建立穩(wěn)定的制備工藝。關(guān)鍵工藝參數(shù)可能包括發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、補料培養(yǎng)基組成、補料時間和補料量、溶氧量、堿裂解緩沖液及中和緩沖液的組成、堿裂解時間、層析柱載量、層析流速等。研究中建議關(guān)注制備全過程對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能的可能影響，如堿裂解步驟可能產(chǎn)生的質(zhì)粒不可逆變性的情況等。純化工藝開發(fā)過程中，可以根據(jù)質(zhì)粒的實際大小和性質(zhì)選擇合適的柱層析填料，最大程度去除宿主RNA、宿主DNA、DNA碎片和細菌內(nèi)毒素等雜質(zhì)。根據(jù)研究，設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)和可接受標(biāo)準(zhǔn)，如質(zhì)粒中間產(chǎn)物的濃度、超螺旋比例、雜質(zhì)殘留量等。

（二）發(fā)酵

需對生產(chǎn)過程中使用的各種原材料進行質(zhì)量控制，以保證這些原材料符合既定用途的要求。需根據(jù)生產(chǎn)過程中培養(yǎng)、增殖和蛋白表達量一致性的研究資料，確定轉(zhuǎn)罐、誘導(dǎo)、終止培養(yǎng)的技術(shù)參數(shù)。需根據(jù)生產(chǎn)工藝驗證資料，明確生產(chǎn)過程中的工藝參數(shù)，如培養(yǎng)基滅菌時間滅菌溫度、培養(yǎng)周期等；同時根據(jù)表達系統(tǒng)差異，針對性的建立細胞（細菌、酵母或其他）生長的主要質(zhì)控指標(biāo)（包括但不限于發(fā)酵液OD值、pH值、目標(biāo)蛋白分子量、蛋白表達量、質(zhì)粒穩(wěn)定性等）。

1.有限代次生產(chǎn)

對于哺乳動物細胞等隨著傳代次數(shù)增加可能喪失穩(wěn)定表達的宿主細胞，需予以有限代次生產(chǎn)；對于大腸桿菌、畢赤酵母等表達相對穩(wěn)定的宿主細胞，必要時進行代次穩(wěn)定性驗證后，可不限定代次生產(chǎn)。用于培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料和方法需有詳細的資料。培養(yǎng)過程及收獲時，需有敏感的檢測措施控制微生物污染。

需提供培養(yǎng)生長濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù)，并需確立廢棄一批培養(yǎng)物的指標(biāo)。根據(jù)宿主細胞／載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料，確定在生產(chǎn)過程中允許的最高細胞倍增數(shù)或傳代代次，并需提供最適培養(yǎng)條件的詳細資料。

在生產(chǎn)周期結(jié)束時，必要時監(jiān)測宿主細胞/載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)粒拷貝數(shù)、宿主細胞中表達載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。一般情況下，用來自一個原始細胞庫的全量培養(yǎng)物進行監(jiān)測，宜適時做一次目的基因的核苷酸序列分析。

2.連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)

基本要求同“1.有限代次生產(chǎn)”。

必要時監(jiān)測經(jīng)長期培養(yǎng)后所表達基因的分子完整性，以及宿主細胞的表型和基因型特征。每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化需在規(guī)定范圍內(nèi)。對可以進行后處理及應(yīng)廢棄的培養(yǎng)物，需確定指標(biāo)。從培養(yǎng)開始至收獲，需有敏感的檢查微生物污染的措施。

根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及表達產(chǎn)物的恒定性資料，需規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時間。如屬長時間連續(xù)培養(yǎng)，需根據(jù)宿主/載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料，在不同間隔時間作全面檢定。

（三）純化

根據(jù)生產(chǎn)工藝需求，可以將純化過程分為粗純、精純、換液、濃縮等工序，關(guān)于純度的要求可視膠原蛋白材料的用途和用法而確定。例如，僅使用一次或需反復(fù)多次使用時，用于健康人群或用于重癥患者時，都可對純度有不同程度要求。不同載體細胞表達系統(tǒng)可能對純化過程的要求有所不同，但所采用的分離、純化、濃縮方法或技術(shù)，需能適用于規(guī)?；a(chǎn)并保持穩(wěn)定。

生產(chǎn)中可能引入一些特定的工藝雜質(zhì)，純化工藝需保證能將其去除或降低至可接受的水平。雜質(zhì)主要包括與工藝相關(guān)的雜質(zhì)和膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)以及環(huán)境污染雜質(zhì)。工藝相關(guān)的雜質(zhì)是指生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，如宿主細胞蛋白、DNA，培養(yǎng)物（誘導(dǎo)劑、抗生素或其他培養(yǎng)基成分等），純化等工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)（酶、化學(xué)試劑、無機鹽、溶劑、載體、抗體等）；膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)是指膠原蛋白材料異質(zhì)性，如肽鏈的截短或延長形式、修飾形式（去酰胺化、異構(gòu)體、二硫鍵錯配、糖基化、磷酸化等）、聚合體、多聚體等；環(huán)境污染雜質(zhì)包括細菌內(nèi)毒素、可能攜帶的病毒和有害微生物等，宿主細胞（如細菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞）的污染也存在潛在的危險性。具體內(nèi)容詳見本指導(dǎo)原則“二（一）5.雜質(zhì)、污染物和添加劑”的內(nèi)容。

對于生產(chǎn)過程中的收獲、分離和純化方法需詳細記述，需特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除，如采用親和層析技術(shù)，例如用單克隆抗體，需有檢測可能污染此類外源性物質(zhì)的方法，不應(yīng)含有可測出的異種免疫球蛋白。需驗證這些分離、純化關(guān)鍵工序及雜質(zhì)檢測方法。對整個純化工藝需進行全面研究，包括對宿主細胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學(xué)物質(zhì)等的去除?？梢圆捎眠^濾、離心等操作進行分離，通過洗濾參數(shù)、相對離心力等工藝參數(shù)進行必要的控制；可以采用蛋白層析或者離子交換層析等技術(shù)進行純化。

可使用層析的方法提高膠原蛋白材料的純度，但需充分考慮到層析參數(shù)的選擇和層析樹脂的質(zhì)量對膠原蛋白材料質(zhì)量的影響，需要重點關(guān)注工藝對病毒的滅活與去除能力。病毒滅活/去除驗證需符合《中華人民共和國藥典》通則“生物制品病毒安全性控制”等技術(shù)文件的要求。所采用的分離、純化工藝需能確保較好地保留膠原蛋白材料的理化和生物學(xué)性質(zhì)，保留目標(biāo)肽段的生物學(xué)活性。

采用乙醇等沉淀法時，需對乙醇等試劑的質(zhì)量進行控制，并對膠原濃度、溫度、pH值、離子強度、處理時間等進行研究，明確可接受的限度范圍。采用層析方法時，需根據(jù)產(chǎn)物中膠原的性質(zhì)和濃度，優(yōu)化色譜條件、確定合理的參數(shù)，如層析柱的容量、料液及緩沖液的離子強度和緩沖液的 pH值、流速、接觸時間和溫度等，這些參數(shù)的確定需以工藝開發(fā)的研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，均需制定限度標(biāo)準(zhǔn)和容許范圍。同時，還需對層析樹脂的清潔、再生（使用壽命）、層析柱的載量、浸出物等進行研究，尤其是使用具有潛在有害配體的層析填料。需關(guān)注每一步分離純化步驟的體積、膠原濃度、回收率、電泳純度等，評估對工藝相關(guān)雜質(zhì)和膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)的去除能力。必要時，為了證明該工藝對雜質(zhì)的清除能力，可能需要采用加標(biāo)試驗評估工藝對某些潛在污染物的清除能力。如涉及中間產(chǎn)物的暫存、運輸?shù)瓤赡苡绊懏a(chǎn)品質(zhì)量的操作時，需有必要的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)支持。

鼓勵采用創(chuàng)新和改進工藝（包括對乙醇分離工藝的改進），提高膠原利用率和質(zhì)量。在前期工藝開發(fā)過程中，需注意關(guān)鍵工藝參數(shù)的識別，關(guān)注不同分離階段工藝控制的完整性、工藝參數(shù)設(shè)置的合理性。如注冊申請人已有相同分離純化工藝的膠原蛋白材料上市，已有工藝研究數(shù)據(jù)、控制參數(shù)等可供借鑒時，需開展新膠原的3批生產(chǎn)規(guī)模工藝驗證。

換液可將蛋白溶劑置換至工藝要求的工作液中，濃縮將蛋白濃縮至工藝要求的濃度。質(zhì)控點通常包括膜截留效率、蛋白含量、電導(dǎo)率等。

需建立重組人源化膠原蛋白原材料成品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗方法，詳見正文“二、（一）重組人源化膠原蛋白原材料性能研究”。對生產(chǎn)過程中的原液、半成品及生產(chǎn)原輔料，需注意如下方面。

1.原液要求

經(jīng)純化、換液、濃縮后即為重組人源化膠原原液。如需加入穩(wěn)定劑或賦形劑，需不影響質(zhì)量檢定，否則需在添加輔料前取樣進行原液檢定。原液的檢測項目取決于工藝的驗證、一致性確認、預(yù)期膠原蛋白材料相關(guān)雜質(zhì)與工藝相關(guān)雜質(zhì)的水平、預(yù)期用途等，需采用適當(dāng)方法對原液質(zhì)量進行檢測，必要時需與參比品進行比較。原液的儲存需通過穩(wěn)定性驗證確定儲存條件和時間。參比品的建立和制備需參照《中華人民共和國藥典》“生物制品國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備和標(biāo)定”的相關(guān)要求或YY/T 1849《重組膠原蛋白》中的相關(guān)要求。

原液的檢測項目可包括蛋白表征研究（如肽段覆蓋率、C端序列、N端序列、氨基酸組成、異質(zhì)組成、X-射線衍射分析（XRD）、掃描電鏡分析、晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究、紅外光譜、圓二色譜、差示掃描量熱分析、等電點、肽圖等指標(biāo)）；理化性能指標(biāo)檢測（如鑒別、pH、蛋白含量、純度、分子量等指標(biāo)）；污染物殘留指標(biāo)檢測（如外源性DNA殘留、宿主細胞蛋白殘留、糖類殘留、抗生素殘留、誘導(dǎo)劑殘留、重金屬總量及微量元素殘留等指標(biāo)）；生物性能指標(biāo)檢測（如微生物限度/無菌、內(nèi)毒素殘留、熱原等指標(biāo)）。基于膠原蛋白材料應(yīng)用風(fēng)險評估，提供研究性資料或驗證報告。

2.半成品要求

可由一批或多批原液合并生產(chǎn)半成品。擬混合的每批原液應(yīng)在有效期內(nèi)，需按規(guī)定的工藝生產(chǎn)、單獨檢驗，并符合相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；混合的各批原液需可有效追溯；需對混合工藝進行驗證。

如需對半成品進行稀釋或加入其他輔料，如防腐劑或賦型劑甘油、甘露醇及緩沖鹽等，需確定半成品的質(zhì)量控制要求，包括檢定項目和可接受標(biāo)準(zhǔn)。檢定項目可包括蛋白含量、pH等指標(biāo)。

3.生產(chǎn)原輔料要求

原輔料需按照國家藥品監(jiān)督管理局有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。動物源性原料的使用需提供來源及質(zhì)控檢測資料；發(fā)酵用培養(yǎng)基若添加β內(nèi)酰胺類抗生素，最終材料成品中不得檢出。