附件：人MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2025年第4號(hào)）.doc

人MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑
注冊(cè)審查指導(dǎo)原則

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。

本指導(dǎo)原則是對(duì)MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供注冊(cè)申請(qǐng)人和技術(shù)審評(píng)人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，也不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則的相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。

一、適用范圍

本指導(dǎo)原則適用于采用熒光探針PCR法，對(duì)預(yù)期或正在服用葉酸的高同型半胱氨酸血癥患者的靜脈全血或口腔拭子等樣本DNA中的MTHFR基因多態(tài)性進(jìn)行體外定性檢測(cè)的試劑，用于葉酸的用藥指導(dǎo)。

對(duì)于采用其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法或其他樣本類型的MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請(qǐng)人可參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對(duì)適用部分進(jìn)行評(píng)價(jià)，并補(bǔ)充其他的評(píng)價(jià)資料。

亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因位于1號(hào)染色體lp36.3位置，基因全長(zhǎng)19.3kb，含有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。MTHFR基因編碼的MTHFR酶是機(jī)體葉酸-甲硫氨酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，催化５,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，而5-甲基四氫葉酸是同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）體內(nèi)代謝的重要底物。

MTHFR基因有多個(gè)單核苷酸多態(tài)性突變位點(diǎn)，MTHFR基因多態(tài)性可導(dǎo)致MTHFR酶活性改變，使機(jī)體活性葉酸水平降低及Hcy水平升高，從而導(dǎo)致心腦血管疾病及不良妊娠等相關(guān)疾病的發(fā)生，例如C677T（rs1801133）位點(diǎn)。MTHFR基因C677T（rs1801133）突變導(dǎo)致MTHFR酶活性及穩(wěn)定性下降，與野生型（CC）相比雜合突變型（CT）使MTHFR酶活性下降30%，純合突變型（TT）使MTHFR酶活性下降65%～70%。

中國高血壓患者存在高Hcy、低葉酸現(xiàn)象，MTHFR基因 C677T（rs1801133）位點(diǎn)TT基因型可以進(jìn)一步增加H型高血壓腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，MTHFR基因檢測(cè)可為臨床H型高血壓的危險(xiǎn)分層提供參考。

對(duì)MTHFR基因C677T（rs1801133）位點(diǎn)進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)，有助于制定合理的葉酸補(bǔ)充方案。　

本指導(dǎo)原則適用于MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑注冊(cè)申請(qǐng)和變更注冊(cè)申請(qǐng)的情形。本指導(dǎo)原則僅針對(duì)MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。

二、注冊(cè)審查要點(diǎn)

（一）監(jiān)管信息

1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼

產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類目錄》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。

2. 其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。

（二）綜述資料

綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。其中，同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從技術(shù)原理、預(yù)期用途、被測(cè)靶標(biāo)（基因多態(tài)性位點(diǎn)）、性能指標(biāo)、臨床應(yīng)用情況等方面詳細(xì)說明申報(bào)產(chǎn)品與目前市場(chǎng)上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。此外，還應(yīng)說明被測(cè)靶標(biāo)純合突變型和雜合突變型在中國人群的發(fā)生頻率。

若被測(cè)靶標(biāo)為新的多態(tài)性位點(diǎn)，申請(qǐng)人還應(yīng)提交支持資料，以證明：1.攜帶新位點(diǎn)等位基因所編碼的MTHFR酶的活性和穩(wěn)定性變化情況；2.攜帶新位點(diǎn)等位基因的患者，其葉酸—甲硫氨酸代謝過程的預(yù)期變化；3.提交充分的臨床證據(jù)證明新位點(diǎn)的臨床意義。

（三）非臨床資料

1. 產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評(píng)價(jià)結(jié)果等，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料及生產(chǎn)工藝要求。

第三類體外診斷試劑應(yīng)當(dāng)提供三個(gè)不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的檢驗(yàn)報(bào)告。如有適用的國家參考品發(fā)布，技術(shù)要求中需體現(xiàn)國家參考品的相關(guān)要求?？商峤簧暾?qǐng)人出具的自檢報(bào)告或委托有資質(zhì)的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的檢驗(yàn)報(bào)告。

如有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。

2. 分析性能研究

注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，并提交詳細(xì)的性能評(píng)估資料，包括試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果及結(jié)論等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能研究的背景信息也應(yīng)在資料中有所體現(xiàn)，包括實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)、適用儀器、試劑規(guī)格、批號(hào)等。分析性能評(píng)估的試驗(yàn)方法可參考國際或國內(nèi)有關(guān)體外診斷試劑性能評(píng)估指導(dǎo)原則進(jìn)行，每項(xiàng)性能評(píng)估應(yīng)采用與適用樣本類型一致的臨床樣本。對(duì)于本類產(chǎn)品建議著重從以下分析性能進(jìn)行研究。

2.1樣本穩(wěn)定性

樣本穩(wěn)定性研究主要包括核酸提取純化前樣本的穩(wěn)定性和提取純化后核酸的穩(wěn)定性兩方面。在包含最不利條件情形的儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存，每間隔一定的時(shí)間段即對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。如聲稱多種適用樣本類型，注冊(cè)申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)不同樣本類型分別進(jìn)行樣本穩(wěn)定性研究。

樣本穩(wěn)定性研究應(yīng)涵蓋檢測(cè)位點(diǎn)的野生型、雜合突變型和純合突變型樣本。

2.2適用的樣本類型

列明產(chǎn)品適用的樣本類型。應(yīng)采用合理方法對(duì)每種樣本類型進(jìn)行適用性研究確認(rèn)，對(duì)于全血樣本還需考察不同抗凝劑的適用性。對(duì)于不可比樣本應(yīng)分別提交相應(yīng)的分析性能研究資料。

2.3準(zhǔn)確度

采用申報(bào)試劑與測(cè)序結(jié)果或已上市產(chǎn)品，使用臨床樣本采用方法學(xué)比對(duì)的方法進(jìn)行申報(bào)試劑的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)。

樣本應(yīng)涵蓋野生型和所有多態(tài)性位點(diǎn)的雜合突變型、純合突變型。

2.4企業(yè)參考品驗(yàn)證

根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2.5精密度

精密度評(píng)價(jià)應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)操作完全按照說明書執(zhí)行，包含核酸提取/純化等樣本處理步驟。樣本應(yīng)至少涵蓋所有多態(tài)性位點(diǎn)的雜合突變型。

精密度評(píng)價(jià)需滿足如下要求：

2.5.1對(duì)可能影響檢測(cè)精密度的主要因素進(jìn)行驗(yàn)證，除檢測(cè)試劑（包括核酸提取/純化組分）本身外，還應(yīng)考慮儀器、操作者、地點(diǎn)、時(shí)間、運(yùn)行、試劑批次等因素。

2.5.2設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間實(shí)驗(yàn)室間以及操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

2.5.3用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本建議至少包含檢出限附近水平和中/高濃度水平，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)與預(yù)期結(jié)果一致。

2.5.4申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)，對(duì)精密度指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如CV值。

2.6檢出限

2.6.1檢出限的確定

MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑的檢出限可定義為：在滿足一定的檢測(cè)準(zhǔn)確性和精密度的條件下，能夠檢出目標(biāo)基因的最低人基因組DNA濃度。檢出限評(píng)價(jià)建議采用臨床樣本，并至少包含所有多態(tài)性位點(diǎn)的雜合突變型。

可采用梯度濃度的人基因組DNA樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，將95%檢出率（n≥20）水平下的最低人基因組DNA濃度，確定為檢出限。系列稀釋度應(yīng)能夠覆蓋大部分檢出概率區(qū)間（0～100%），可根據(jù)各濃度梯度檢測(cè)結(jié)果直接判定，也可通過概率計(jì)算或其他適當(dāng)方法進(jìn)行測(cè)算。

2.6.2檢出限的驗(yàn)證

另外選擇不同來源的至少3個(gè)臨床樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)行至少20次檢測(cè)，應(yīng)達(dá)到95%檢出率要求。

檢出限驗(yàn)證的樣本型別應(yīng)覆蓋所有多態(tài)性位點(diǎn)的不同基因型別。

同時(shí)，申請(qǐng)人亦應(yīng)評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品可準(zhǔn)確檢出的人基因組DNA濃度上限，即適當(dāng)檢出率水平下的最高人基因組DNA濃度。

應(yīng)提供詳細(xì)的樣本型別和濃度的確定方法。

2.7分析特異性

2.7.1交叉反應(yīng)

應(yīng)針對(duì)靶基因序列相近或同源性序列（例如MTHFR的其他位點(diǎn)突變序列）進(jìn)行交叉反應(yīng)驗(yàn)證，同時(shí)申請(qǐng)人還應(yīng)驗(yàn)證檢測(cè)范圍內(nèi)各突變位點(diǎn)間的交叉干擾（如適用）。說明交叉反應(yīng)樣本的制備方法、核酸序列確認(rèn)方法，提交詳細(xì)的驗(yàn)證資料。

2.7.2干擾物質(zhì)

應(yīng)針對(duì)可能的內(nèi)源和外源性干擾物進(jìn)行干擾試驗(yàn)研究。干擾物的選擇與所用樣本類型有關(guān)，例如：對(duì)于全血樣本，內(nèi)源干擾物主要涉及血脂、膽紅素、血紅蛋白和白蛋白等，外源干擾物主要包括血液樣本采集可能用到的抗凝劑和常用藥物（如降壓藥、調(diào)脂藥、降糖藥、解熱鎮(zhèn)痛藥等）；對(duì)于口腔拭子樣本，干擾物需考慮全血、口腔定植菌以及口腔可能接觸到的抗菌漱口液、牙膏、食物、藥物（如：硝酸甘油、口腔噴霧劑）、煙草等。

干擾試驗(yàn)可通過在臨床樣本中人工添加干擾物質(zhì)的方式，評(píng)價(jià)干擾物質(zhì)對(duì)目標(biāo)基因檢測(cè)的影響，也可直接采集暴露于干擾因素后的受試者樣本，進(jìn)行干擾試驗(yàn)評(píng)價(jià)。建議申請(qǐng)人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)；如有干擾，應(yīng)確定不產(chǎn)生干擾的最高濃度。

2.8核酸提取/純化性能

在進(jìn)行核酸檢測(cè)之前，建議有核酸提取/純化步驟。無論檢測(cè)試劑是否含有核酸提取/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測(cè)試劑的特性，對(duì)配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并評(píng)價(jià)該方法能否滿足MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑的要求，提供詳細(xì)的評(píng)價(jià)資料。

若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測(cè)試劑進(jìn)行精密度、檢出限和抗干擾的驗(yàn)證。

2.9反應(yīng)體系

2.9.1樣本采集和處理

請(qǐng)?jiān)斒鰳颖镜牟杉吞幚矸绞?，明確樣本的保存介質(zhì)。

對(duì)于口腔拭子樣本，還應(yīng)提供采樣拭子及樣本保存介質(zhì)（如：樣本保存液）的選擇研究，明確對(duì)拭子頭和拭子桿的材質(zhì)要求、保存液或裂解液的成分、濃度和使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗(yàn)證檢出限和重復(fù)性。

2.9.2反應(yīng)體系確定

依據(jù)產(chǎn)品特性，提供最佳反應(yīng)體系確定的研究資料，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各試劑組分加樣量及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。

如有多個(gè)適用機(jī)型，需提交不同適用機(jī)型基線和閾值確定的研究資料。不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。

3. 穩(wěn)定性研究

申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

4. 陽性判斷值研究

對(duì)于此類試劑，陽性判斷值即為能夠獲得理想的檢測(cè)準(zhǔn)確性的臨界值（Cut-off）。建議納入一定數(shù)量的臨床樣本，涵蓋野生型和所有多態(tài)性位點(diǎn)的雜合突變型和純合突變型，采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式進(jìn)行研究。亦可采用其他科學(xué)合理的方法進(jìn)行陽性判斷值研究。相關(guān)資料中應(yīng)詳述試驗(yàn)方案、樣本來源、樣本量、樣本入組標(biāo)準(zhǔn)及試驗(yàn)結(jié)果等。如試劑判讀存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說明灰區(qū)范圍的確定方法。如采用其他方法對(duì)陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說明這種方法的合理性。
如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對(duì)各樣本類型分別進(jìn)行陽性判斷值研究。

對(duì)于某些檢測(cè)方法學(xué)，陽性判斷值研究可能不適用，申請(qǐng)人應(yīng)說明理由。

5. 其他資料

5.1主要原材料研究資料

該類產(chǎn)品的主要原材料一般包括人基因組核酸提取/純化試劑、檢測(cè)所需引物、探針、酶、dNTP、反應(yīng)緩沖液等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對(duì)比篩選試驗(yàn)資料、生產(chǎn)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。

5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、模板核酸序列及兩者的對(duì)應(yīng)情況。建議設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，針對(duì)待測(cè)位點(diǎn)的特異性等進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇最佳引物探針組合，并提交詳細(xì)的篩選研究數(shù)據(jù)。

申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)選定的引物、探針原材料進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，一般包括：分子量、純度（HPLC等）、濃度、序列準(zhǔn)確度、探針熒光標(biāo)記基團(tuán)，以及功能性試驗(yàn)等，并依據(jù)評(píng)價(jià)結(jié)果建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP，應(yīng)提交對(duì)其純度、濃度等的驗(yàn)證資料，以及功能性試驗(yàn)資料，并確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

5.1.3酶：涉及的酶主要包括DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）等。申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)各種酶的活性進(jìn)行驗(yàn)證，提交功能性試驗(yàn)資料，并確定酶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

DNA聚合酶應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性。UDG/UNG應(yīng)具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。

5.1.4質(zhì)控品

MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑的質(zhì)控品可分別設(shè)置野生型、雜合突變型及純合突變型，同時(shí)設(shè)置不含待測(cè)靶序列的空白質(zhì)控品用于交叉污染的質(zhì)控；亦可直接采用待測(cè)位點(diǎn)的雜合突變型樣品及空白質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制。

對(duì)于此類產(chǎn)品，一般情況下，反應(yīng)體系中野生型序列和突變型序列均有陽性反應(yīng)，可以對(duì)管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，則試劑盒中可不另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)對(duì)照；否則，應(yīng)另外設(shè)置內(nèi)標(biāo)對(duì)照。

質(zhì)控體系應(yīng)能夠?qū)z測(cè)全過程進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，包括試劑及儀器性能、可能的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物（管內(nèi)抑制）、交叉污染等因素造成的假陰性或假陽性結(jié)果。質(zhì)控品可采用質(zhì)粒、細(xì)胞系或臨床樣本的核酸提取液等?？瞻踪|(zhì)控品應(yīng)參與樣本核酸的平行提取。申請(qǐng)人應(yīng)針對(duì)質(zhì)控品原料選擇、制備、定值過程等提供詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)，并對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求。

5.1.6企業(yè)參考品

企業(yè)參考品一般包括準(zhǔn)確性參考品、特異性參考品、檢出限參考品和精密度參考品等。申請(qǐng)人應(yīng)提交有關(guān)企業(yè)參考品原料選擇、制備方法、基因型別確認(rèn)及檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的研究資料等。

準(zhǔn)確性參考品：可采用臨床樣本，樣本類型與待測(cè)樣本一致。應(yīng)包含野生型和所有多態(tài)性位點(diǎn)的雜合突變型樣本、純合突變型樣本。

特異性參考品：應(yīng)考慮檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià)，建議包括同源序列交叉反應(yīng)樣本、干擾樣本等。特異性參考品可采用細(xì)胞系進(jìn)行制備；

檢出限參考品：可選擇檢出限濃度（例如：95%檢出率水平）或接近檢出限濃度（例如100%檢出率水平）的臨床樣本，應(yīng)至少包含所有多態(tài)性位點(diǎn)的雜合突變型樣本。

精密度參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。至少包括所有多態(tài)性位點(diǎn)的雜合突變型臨床樣本。

如MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑已有國家參考品，企業(yè)參考品的要求應(yīng)不低于國家參考品要求。

5.2生產(chǎn)工藝研究資料

生產(chǎn)工藝研究資料包括工作液配制（引物、探針濃度、酶濃度、dNTP濃度、緩沖液離子濃度等）、分裝和凍干（如有）、熒光標(biāo)記等工藝過程的描述及確定依據(jù)。生產(chǎn)過程應(yīng)對(duì)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制，可采用流程圖方式描述生產(chǎn)工藝，標(biāo)明關(guān)鍵工藝質(zhì)控步驟，并詳細(xì)說明該步驟的質(zhì)控方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

（四）臨床評(píng)價(jià)資料

臨床試驗(yàn)的開展、方案的制定以及報(bào)告的撰寫等均應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)及《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（國家藥品監(jiān)督管理局通告2021年第72號(hào)）的要求，如相關(guān)法規(guī)、文件有更新，臨床試驗(yàn)應(yīng)符合更新后的要求。

1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)

應(yīng)選擇不少于3家（含3家）已備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗(yàn)。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)人種和流行病學(xué)背景等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，操作人員應(yīng)熟悉臨床試驗(yàn)方案及檢測(cè)系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)。

2.臨床試驗(yàn)方法

2.1對(duì)于有已上市同類產(chǎn)品（突變位點(diǎn)為C677T，rs1801133）的產(chǎn)品，建議申請(qǐng)人選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市的同類產(chǎn)品作為對(duì)比試劑，采用試驗(yàn)體外診斷試劑與之進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究，評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品的臨床性能。對(duì)比試劑的選擇應(yīng)從預(yù)期用途、樣本要求、檢測(cè)性能等方面，確認(rèn)其與申報(bào)產(chǎn)品具有較好的可比性。

2.2如申報(bào)新的突變位點(diǎn)用于葉酸用藥指導(dǎo)，應(yīng)根據(jù)其公認(rèn)的臨床意義，提供其適用人群相應(yīng)的臨床意義的證據(jù)及性能驗(yàn)證臨床試驗(yàn)。性能驗(yàn)證臨床試驗(yàn)中可以選擇公認(rèn)的參考方法（如Sanger測(cè)序法）作為對(duì)比方法，評(píng)價(jià)其突變位點(diǎn)的檢測(cè)性能。臨床意義的證據(jù)應(yīng)包括新的突變位點(diǎn)基因型與血液同型半胱氨酸含量、紅細(xì)胞中葉酸含量，服用葉酸劑量與相應(yīng)結(jié)局的相關(guān)性研究證據(jù)。

針對(duì)Sanger測(cè)序和相關(guān)性研究分析方法（如涉及）的建立、驗(yàn)證和質(zhì)量控制，應(yīng)提交詳細(xì)的研究論述，相關(guān)內(nèi)容納入臨床試驗(yàn)報(bào)告中。

3.受試者選擇和樣本類型

3.1受試者選擇

臨床試驗(yàn)中應(yīng)選擇高同型半胱氨酸血癥患者作為適用人群。如需要服用或正在服用葉酸的H型高血壓等心腦血管疾病患者等。

如涉及新的位點(diǎn)及臨床使用場(chǎng)景，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)的適用人群納入受試者。

3.2 樣本類型

適用的樣本類型一般為靜脈抗凝全血，應(yīng)采用相同樣本類型的已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較研究。

如產(chǎn)品同時(shí)適用于口腔拭子，可與相同樣本類型或靜脈全血的已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較研究；也可采用與申報(bào)產(chǎn)品的靜脈全血進(jìn)行同源比對(duì)的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)，純合突變型/雜合突變型/野生型樣本例數(shù)建議均不少于100例。

臨床試驗(yàn)中應(yīng)以臨床原始樣本進(jìn)行試驗(yàn)，不應(yīng)直接采用提取的基因組DNA。臨床樣本的采集、處理、保存和提取等應(yīng)同時(shí)滿足申報(bào)產(chǎn)品說明書以及對(duì)比試劑說明書（如適用）的相關(guān)要求。

4.臨床試驗(yàn)樣本量

臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行估算，同時(shí)應(yīng)滿足法規(guī)最低樣本量的要求。根據(jù)相應(yīng)臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)，本臨床試驗(yàn)可依據(jù)申報(bào)產(chǎn)品相對(duì)于對(duì)比試劑的純合突變型/雜合突變型/野生型符合率分別估算相應(yīng)的最低樣本例數(shù)。

與對(duì)比試劑的比較研究中，臨床樣本量的估算建議采用單組目標(biāo)值法進(jìn)行計(jì)算，純合突變型/雜合突變型/野生型符合率的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)（P0）建議均不低于95%。當(dāng)評(píng)價(jià)指標(biāo)PT接近100%時(shí)，該樣本量估算方法可能不適用，應(yīng)考慮選擇更加適宜的方法進(jìn)行樣本量估算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，如精確概率法等。

公式中，n為樣本量；Z1-α/2、Z1-β為顯著性水平和把握度的標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)分布的分?jǐn)?shù)位，P0為評(píng)價(jià)指標(biāo)的臨床可接受標(biāo)準(zhǔn)，PT為申報(bào)產(chǎn)品評(píng)價(jià)指標(biāo)預(yù)期值。

臨床試驗(yàn)總體樣本量確定時(shí)應(yīng)在上述各型別樣本最低樣本量估算的基礎(chǔ)上，同時(shí)考慮其他可能造成受試者脫落的情況適當(dāng)增加入組樣本量。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

依據(jù)年齡、性別和臨床診斷背景信息等，對(duì)納入統(tǒng)計(jì)的病例進(jìn)行人口學(xué)分析。

總結(jié)野生型、雜合突變型和純合突變型的例數(shù)，以3×3表分別總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果，并分別計(jì)算各基因型的符合率、總體符合率及其95%置信區(qū)間，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行kappa檢驗(yàn)，以評(píng)價(jià)兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性；以交叉四格表分別總結(jié)兩種試劑對(duì)野生型及突變型（包括雜合突變型和純合突變型）的定性檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算符合率、總符合率及其95%置信區(qū)間，并對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行kappa檢驗(yàn)，以驗(yàn)證兩種試劑檢測(cè)結(jié)果的一致性。

對(duì)于兩種試劑檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用合理方法進(jìn)行復(fù)核，并對(duì)差異原因進(jìn)行分析。

6.倫理學(xué)要求

臨床試驗(yàn)必須符合赫爾辛基宣言的倫理學(xué)準(zhǔn)則。研究者應(yīng)考慮臨床試驗(yàn)用樣本的獲得和試驗(yàn)結(jié)果對(duì)受試者的風(fēng)險(xiǎn)，提請(qǐng)倫理委員會(huì)審查，并獲得倫理委員會(huì)的同意。注冊(cè)申報(bào)時(shí)應(yīng)提交倫理委員會(huì)的審查意見。

7.臨床試驗(yàn)方案

各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

試驗(yàn)方案應(yīng)確定嚴(yán)格的入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已入選的樣本被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程和結(jié)果判定時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。

8.質(zhì)量控制

臨床試驗(yàn)開始前，建議進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。整個(gè)試驗(yàn)過程都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及精密度。

9.臨床試驗(yàn)小結(jié)與報(bào)告

臨床試驗(yàn)的小結(jié)與報(bào)告應(yīng)該對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫參考《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求。

（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿

產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊(cè)申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。人MTHFR基因多態(tài)性檢測(cè)試劑說明書編寫應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。

1.【預(yù)期用途】 應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

1.1本產(chǎn)品用于體外定性檢測(cè)人體XX樣本中的MTHFR基因XX位點(diǎn)的多態(tài)性。

1.2介紹被測(cè)靶標(biāo)（基因多態(tài)性位點(diǎn)），說明基因位點(diǎn)與臨床適用癥的關(guān)系，明確野生型、雜合突變型和純合突變型的臨床發(fā)生頻率，明確可進(jìn)行葉酸用藥指導(dǎo)的適用人群。

1.3明確本產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者是否用藥的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、療效及其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)等對(duì)本產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

2.【檢驗(yàn)原理】

對(duì)試劑盒的被測(cè)靶標(biāo)進(jìn)行詳細(xì)描述（基因位置、多態(tài)性位點(diǎn)及相關(guān)特征等），對(duì)試劑盒所用探針、引物、多態(tài)性的判定終點(diǎn)等進(jìn)行詳細(xì)的介紹；對(duì)不同樣本反應(yīng)管組合、質(zhì)控品設(shè)置及熒光信號(hào)檢測(cè)原理等進(jìn)行介紹。

試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行適當(dāng)介紹。

3.【主要組成成分】

明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號(hào)及注冊(cè)證號(hào)、備案號(hào)等信息。

4.【儲(chǔ)存條件及有效期】

說明試劑盒的效期穩(wěn)定性等，明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期等信息。

5.【樣本要求】

應(yīng)明確樣本采集、處理、保存等各環(huán)節(jié)要求，說明樣本保存條件及期限等。冷藏/冷凍樣本檢測(cè)前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。

6.【適用儀器】

注明所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

7.【檢驗(yàn)方法】

詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：

7.1實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。

7.2試劑配制方法和注意事項(xiàng)。

7.3簡(jiǎn)述核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用），對(duì)核酸提取純化環(huán)節(jié)進(jìn)行合理的質(zhì)量控制。

7.4擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。

7.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測(cè)程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。

7.6儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測(cè)多態(tài)性及其他質(zhì)控品的熒光通道選擇等。

8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

結(jié)合質(zhì)控品、樣本管檢測(cè)結(jié)果以及多態(tài)性類型與葉酸代謝表型之間的關(guān)系，以列表形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測(cè)灰區(qū)，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。

9.【檢驗(yàn)方法局限性】

9.1申報(bào)產(chǎn)品僅對(duì)MTHFR 基因XX位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行了驗(yàn)證。

9.2有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

9.2.1不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理或核酸過度降解均有可能導(dǎo)致檢測(cè)失敗。

9.2.2未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或PCR抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

詳述以下性能指標(biāo)：

10.1國家參考品和企業(yè)參考品的符合情況。

10.2檢出限：簡(jiǎn)單介紹檢出限的確定方法，并明確檢出限結(jié)果。

10.3精密度：簡(jiǎn)單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。

10.4分析特異性

10.4.1交叉反應(yīng)驗(yàn)證：同源性序列等交叉反應(yīng)驗(yàn)證。

10.4.2干擾物質(zhì)驗(yàn)證：樣本中常見干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

10.5臨床試驗(yàn)：介紹試驗(yàn)方法、受試者及樣本、試驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論等。

11.【注意事項(xiàng)】

11.1如產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告。

11.2 試劑保存運(yùn)輸及使用過程中多種因素可能導(dǎo)致性能變化，如保存運(yùn)輸不當(dāng)、樣本采集、樣本處理及檢測(cè)過程操作不規(guī)范等，請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書操作。

11.3臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。

三、參考文獻(xiàn)

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